PCR-关键技术的种类及其应用.doc
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1、PCR 技术种类及其应用 1 PCR 技术基本原理PCR 技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在条件下,依赖于DNA聚合酶(T aq 酶)酶促合成反映。其详细反映分三步:变性、退火、聚合。以上三步为一种循环, 每一循环产物DNA又可以作为下一种循环模板,数小时后,介于两个引物之间目DNA得到了大量复制,经2530次循环DNA数量可达21067拷贝数。2PCR技术种类2.1 反向PCR( Inverse PCR,IPCR)技术原理:反向PCR是克隆已知序列旁侧序列一种办法重要原理是用一种在已知序列中无切点限制性内切酶消化基因组I)NA后酶切片段自身环化以环化DNA作为模板,用一对与已知序列
2、两端特异性结合引物,扩增夹在中间未知序列。该扩增产物是线性DNA片段,大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部酶切位点分布状况。用不同限制性内切酶消化,可以得到大小不同模板DNA,再通过反向PCR获得未知片段 。该办法局限性是:需要从许多酶中选取限制酶,或者说必要选取一种适当酶进行酶切才干得到合理大小DNA片段。这种选取不能在非酶切位点切断靶DNA。大多数有核基因组具有大量中度和高度重复序列,而在YAC或Cosmid中未知功能序列中有时也会有这些序列,这样,通过反向PCR得到探针就有也许与各种基因序列杂交。2.2锚定PCR(Anchored PCR,APCR)技术用酶法在一通用引
3、物反转录cDNA3-末端加上一段已知序列,然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增,称为APCR。应用:它可用于扩增未知或全知序列,如未知cDNA制备及低丰度cDNA文库构建。2.3不对称PCR(asymmetric PCR)技术两种引物浓度比例相差较大PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同引物浓度,惯用501001比例。在最初1015个循环中重要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导PCR反映就会产生大量单链DNA。应用:可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交探针。2.4反转录PCR(reverse transcription,RT- PCR)技术当扩
4、增模板为RNA时,需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才干进行扩增。RT - PCR应用非常广泛,无论是分子生物学还是临床检查等都经常采用。2.5修饰引物PCR技术为达到某些特殊应用目,如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等,可在引物5-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等 。2.6巢式PCR(NEST PCR)技术先用一对靶序列外引物扩增以提高模板量,然后再用一对内引物扩增以得到特异PCR带,此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR操作环节可将外引物设计得比内引物长些,且用量较少,同步在第一次PCR时采用较高退火温度而第二次采用较低
5、退火温度,这样在第一次PCR时,由于较高退火温度下内引物不能与模板结合,故只有外引物扩增产物,通过若干次循环,待外引物基本消耗尽,无需取出第一次PCR产物,只需减少退火即可直接进行PCR扩增。这不但减少操作环节,同步也减少了交叉污染机会。这种PCR称半途进退式PCR( drop-in,drop-out PCR)。上述三种办法重要用于很少量DNA模板扩增。2.7等位基因特异性PCR(Allele- specificPCR,ASPCR)技术ASPCR依赖于引物3- 端一种碱基错配,不但减少多聚酶延伸效率,并且减少引物-模板复合物热稳定性。这样有点突变模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测
6、基因点突变。2.8单链构型多态性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR,SSCPPCR)技术SSCP- PCR是依照形成不同构象等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移率变化来检测基因变异。在不含变性剂中性聚丙烯酰胺凝胶中,单链DNA迁移率除与DNA长度关于外,更重要取决于DNA单链所形成空间构象,相似长度单链DNA因其顺序不同或单个碱基差别所形成构象就会不同,PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时,每条单链处在一定位置,靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时,就会浮现泳动变位,从而提示该片段有基因变异存在。2. 9低
7、严格单链特异性引物PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR,LSSP- PCR)技术LSSP - PCR 是建立在PCR 基本上又一种新型基因突变检测技术。规定是“二高一低”,高浓度单链引物( 5- 端/ 3- 端引物均可),约4. 8Lmol,高浓度Taq 酶( 16Lmol/ 100ml) ,低退火温度( 30),所用模板必要是纯化DNA片段。在这种低严格条件下,引物与模板间发生不同限度错配,形成各种大小不同扩增产物,经电泳分离后形成不同带型。对同一目基因而言,所形成带型是固定,因而称之为“基因标签”。这是一种检测基因突变或进行遗传鉴定迅速敏
8、感办法。2.10复合PCR(multiplex PCR)技术在同一反映中用多组引物同步扩增几种基因片段,如果基因某一区段有缺失,则相应电泳谱上这一区带就会消失。复合PCR重要用于同一病原体分型及同步检测各种病原体、各种点突变分子病诊断。2.11重组PCR技术重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中,两对引物分别由其中之一在其5-端和3-端引物上带上一段互补序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反映,产生一种包括两个不同基因杂合基因。2.12随机引物扩增技术(arbitrary primedPCR,AP- PCR
9、)AP-PCR技术通过随意设计或选取一种非特异性引物,在PCR反映体系中,一方面在不严格条件下使引物与模板中许多序列通过错配而复性。如果在两条单链上相距一定距离有反向复性引物存在,则可经Taq酶作用使引物延伸而发生DNA片段扩增,经一至数轮不严格条件下PCR循环后,再于严格条件下进行扩增。扩增产物经DNA测序凝胶电泳分离后,经放射性自显影或荧光显示即可得到DNA指纹图。AP-PCR用于肿瘤抑制基因、癌基因分离;菌种、菌株及不同物种鉴定;遗传作图;不同分化限度或某些不同状态下组织基因表达差别等方面研究。2.13 差示PCR (differential PCR,d -PCR)技术d-PCR可以定量
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