外周血神经丝蛋白轻链多肽含量与神经压迫性疼痛程度相关性研究.pdf

基金项目:江苏省博士后资助项目(2019Z156);泰州市人民医院院级课题(ZL201929)通信作者,E-mail:87447669 外周血神经丝蛋白轻链多肽含量与神经压迫性疼痛程度相关性研究李城1,姚吉祥1,金世光2,伏小阳2(1.南京医科大学附属泰州人民医院疼痛科,江苏 泰州 225300;2.南京医科大学附属泰州人民医院中心实验室)摘要:目目的的 探讨外周血神经丝蛋白轻链多肽(Nefl)水平与神经根性颈椎病(CSR)疼痛程度的相关性,并评估其是否可作为 CSR 进展的生物标志物。方方法法 健康 SD 大鼠 18 只,随机数字表法分为 2 组,Sham 组(9 只)和大鼠坐骨神经慢性压迫损伤模型(CCI)组(9 只)。Sham 组暴露坐骨神经后缝合皮肤,CCI 组暴露坐骨神经后先环扎再缝合皮肤;于术前,术后 1、3、7、14 d 采用电子测痛仪检测 2 组大鼠机械缩足反应阈值(MWT);并采集外周血进行定量蛋白质组分析,采用 ELISA 方法检测 Nefl 蛋白表达水平。将 80 例 CSR 患者作为研究组,同期体检的 24 例健康人群作为对照组,收集疼痛视觉模拟评分(VAS)结果,采用 ELISA 方法检测外周血 Nefl 蛋白表达;Spearman 秩相关系数法评价外周血 Nefl 表达水平随疼痛程度的变化规律。结结果果CCI 组大鼠术前,术后 1、3、7、14 d MWT 持续下降;3、7、14 d 时 MWT 显著低于 Sham 组(P0.01);TMT 标记定量蛋白质组分析显示 Nefl 蛋白表达显著上调,Log(foldchange)=1.14,P0.05;CCI 组大鼠术前,术后 1、3、7、14 d 外周血 Nefl 蛋白表达量持续上升,Sham 组 3、7、14 d 逐渐下降,MWT 与大鼠外周血 Nefl 蛋白表达量呈负相关(r=-0.662,P0.01)。CSR 患者外周血 Nefl 表达显著高于健康人群(P0.01),VAS 为 8 分患者显著高于 VAS 为 6 分的患者(P0.01),VAS 与外周血 Nefl 呈正相关(r=0.41,P0.01)。结结论论 CCI 模型大鼠和 CSR 患者外周血 Nefl 表达显著增加,且与疼痛程度相关,Nefl 可作为临床上 CSR 病情进展评估的生物标志物。关键词:神经根型颈椎病;神经丝蛋白轻链多肽;坐骨神经慢性压迫损伤模型;疼痛视觉模拟评分;生物标志物;定量蛋白质组分析中图分类号:R744.2 文献标志码:A 文章编号:2096-3882(2024)02-0119-05DOI:10.3969/j.issn.2096-3882.2024.02.007Correlation between the content of peripheral blood neurofilament light chain polypeptides and the extent of neural compressive painLI Cheng1,YAO Jixiang1,JIN Shiguang2,FU Xiaoyang2(1.Department of Pain,the Affiliated Taizhou Peoples Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing Medical University,Taizhou,Jiangsu 225300,China;2.Department of Central Laboratory,the Affiliated Taizhou Peoples Hospital of Nanjing Medical University)Abstract:ObjectiveTo explore the correlation between the levels of peripheral blood neurofilament light chain peptide(Nefl)and the severity of pain in cervical spondylotic radiculopathy(CSR),and assess whether Nefl can serve as a biomarker for the progression of CSR.Methods According to the random number table method,18 healthy SD rats were divided into two groups(n=9):a Sham group and a chronic constriction injury(CCI)group.In the Sham group,the sciatic nerve was exposed and the skin was sutured.In the CCI group,the sciatic nerve was exposed and the skin was sutured after being looped.Then,their mechanical withdrawal thresholds(MWT)were measured by an electronic pain meter before operation and on post-operation days 1,3,7,and 14.Peripheral blood samples were collected for quantitative proteomic analysis.The levels of peripheral blood Nefl were detected by ELISA.Furthermore,80 patients with CSR were selected as an experimental group,and 24 healthy individuals who underwent physical examination at the same time were selected as acontrol group.The visual analog scale(VAS)scores were collected,and the levels of Nefl protein in peripheral blood was detected by ELISA.The Spearman rank correlation coefficient method was used to evaluate the correlation between the levels of Nefl in peripheral blood and the severity of pain.Results Rats in the CCI group showed 911徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(2)consistent declines in MWT before operation and on post-operation days 1,3,7,and 14,and its MWT values on post-operation days 3,7,and 14 significantly lower than those in the Sham group(P0.01).According to the TMT-marked quantitative proteomic analysis,Nefl resulted in significantly up-regulated protein expression,with Log(foldchange)=1.14 and P 0.05.Furthermore,the rats in the CCI group presented consistent increases in Nefl protein contents of the peripheral blood before operation and on post-operation days 1,3,7,and 14.In contrast,the Sham group showed gradual decreases in Nefl protein contents on post-operation days 3,7,and 14.There was a negative correlation between MWT and Nefl protein contents in the peripheral blood of rats(r=-0.662,P0.01).CSR patients showed significantly higher expression of Nefl in the peripheral blood than that in healthy individuals(P0.01).Patients with VAS score 8 presented significantly higher Nefl protein contents than those with VAS score 6(P0.01).There was a positive correlation between VAS and Nefl protein contents in the peripheral blood of rats(r=0.41,P0.05),具有可比性。使用 EDTA 抗凝管采集 2 组人群外周血离心分离血浆(每例 1 ml),置于-80 冰箱保存备用。本研究获得南京医科大学附属泰州人民医院伦理委员会批准(KY2023-176-01),所有研究对象均签署知情同意书。1.3 主要试剂和仪器 Nefl ELISA 试剂盒(E-EL-H0741c,武汉伊莱瑞特);SynergyHT 多功能微孔板检测系统(美国 BioTek),电子测痛仪(美国 IITC)。1.4 构建 CCI 疼痛模型 18 只 SD 大鼠用随机数字表法分为假手术组(Sham)和模型组(CCI),每组各9 只,用 tiletamine-zolazepam(商品名:舒泰)麻醉(60 mg/kg)后,暴露各组大鼠右侧坐骨神经干。Sham 组直接缝合肌肉、筋膜和皮肤。而 CCI 组在坐骨神经距离三叉分支前 2 mm 处用 4-0 羊肠线环扎神经干 4道,间隔 1 mm,力度至周围肌肉产生短暂抽搐为止,随后再进行缝合。各组大鼠于术前,术后 1、3、7、14 d使用 EDTA 抗凝管尾尖采血,1 700 g 离心 10 min 取血浆,置于-80 冰箱保存备用。1.5 机械缩 足 反 应 阈 值(mechanical withdrawal 021徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(2)threshold,MWT)测定 术前,术后 1、3、7、14 d 将每只大鼠单独置于网笼中,待其适应环境并保持安静状态后使用 Electronic von Frey 刺激针针刺大鼠术侧肢足底,记录力度,截止设置为 60 g,重复 3 次,每次间隔 1 min,记录大鼠出现抬足反应时的数值,将平均值设定为 MWT。CCI 组相比术前出现 MWT 下降 25%以上认为模型构建成功。1.6 定量蛋白质组分析 取术前和术后 14 d CCI 建模大鼠的血浆样本进行定量蛋白质组分析,首先样品通过裂解液和离心取上清液的方法获得总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。随后取 50 g 的蛋白使用胰蛋白酶酶解和 TMT 标记,使用 Agilent Zorbax Extend-C18窄径柱进行反向色谱分离,最后进行 LC-MS/MS 上机,生成测序原始数据。按照 Score Sequest HT0,u-nique peptide1,去除空白值的标准筛选可信蛋白;在此基础上,以 Foldchange1.2 或 Foldchange1/1.2 且 P 值0.05),术后 3、7、14 d 时,CCI 组 MWT 显著低于Sham 组(P0.01)。见图 1。图 1 术前,术后 1、3、7、14 d 大鼠 MWT 变化2.2 TMT 分析结果 表达差异分析显示,CCI 建模14 d 组与术前组相比,5 164 个蛋白中,113 个显著上调,前 10 位包括:Plpp7、Ca5b、Nefl、Atp1b4、Mybph、Gapdh-ps17、Slitrk3、Fdx1、Pgm1、Gdap1;78 个显著上调,前 10 位包括:Dmtm、A1i3、RGD1565617、Tnpo2、Cdk1、ENSRNOG00000063615、Mug2、Slc14a1、Lin28b、Snoa。上调、下调前 10 位蛋白的互作分析结果显示,其中 Nefl 与 Gdap1、Cdk1、Lin28b、Slitrk3 连接是关键蛋白。GO 富集分析显示,显著上调的蛋白在 GO 数据库生物学过程大类最多富集于 glycosylceramide catabolic process,分子功能大类最多富集于 cytosolic ribosome,细胞定位大类最多富集于 alpha-galactosi-dase activity;显著下调的蛋白在 GO 数据库生物学过程大类最多富集于 maintenance of protein location in cell,分子功能大类最多富集于 blood microparticle,细胞定位大类最多富集于 selenium binding。KEGG 通路富集分析显示,显著上调的蛋白主要富集在 Sulfur relay system、globo and isoglobo series、Ribosome、Nitro-gen metabolism、Sulfur metabolism;显著下调的蛋白主要富集在 Pantothenate and CoA biosynthesis、Autoph-agy-other、Drug metabolism-other enzymes、Glutathione metabolism、Complement and coagulation cascades。2.3 大鼠血浆 Nefl 蛋白含量变化 Sham 组大鼠血浆 Nefl 蛋白含量术前和术后 1 d 呈现上升趋势,术后3、7、14 d 逐渐下降至术前水平。CCI 组术前,术后 1、3、7、14 d 大鼠血浆 Nefl 蛋白含量持续上升,7 d 和14 d 时 CCI 组大鼠血浆 Nefl 蛋白含量高于 Sham 组(P0.01,图 2A)。Spearman 相关分析表明,血浆中 Nefl蛋白含量与 MWT 呈负相关(r=-0.662,P0.01,图 2B)。121徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(2)A.Sham 和 CCI 组大鼠血浆中 Nefl 蛋白含量测定结果;B.大鼠血浆 Nefl 蛋白含量与 MWT 测定结果相关性分析图 2 Sham 和 CCI 组大鼠外周血 Nefl 含量测定2.4 健康人群和 CSR 患者外周血 Nefl 蛋白含量测定结果 CSR 组与对照组临床资料见表 1。CSR 患者血浆中 Nefl 蛋白含量显著高于健康人群(P 0.01),VAS 为 6 分的 CSR 患者血浆中 Nefl 蛋白含量显著低于 VAS 为 8 分的 CSR 患者(P0.01),病程17 个月的 CSR 患者血浆中 Nefl 蛋白含量显著高于病程17 个月的 CSR 患者。见表 2。ROC 曲线下面积为 0.745(95%CI:0.6520.838)。cut-off 值为 58.11 ng/L,对应敏感度 51.25%,特异度 100%(图 3)。表 1 CSR 组与对照组临床资料临床特征对照组(n=24)CSR 组(n=80)年龄(岁)56.581.0556.311.16性别例(%)男9(37.50)21(26.30)女15(62.50)59(73.80)病程(月)17.335.38VAS(分)7.140.68表 2 CSR 患者与对照组外周血 Nefl 蛋白含量测定指标CSR 组(n=80)对照组(n=24)均值59.9937.62病程(月)41.1779.0834.6552.24 1749.18(46.7184.82)1762.57(34.8970.30)VAS(分)642.37(32.0458.58)752.47(41.8770.30)880.14(52.01103.08)图 3 ROC 分析血浆 Nefl 蛋白含量对 CSR 的诊断作用3 讨 论神经根型颈椎病重要特征之一为对神经根造成机械压迫和炎性刺激,进而造成神经元轴索损伤、功能异常和死亡7。神经丝对神经元轴索损伤和死亡特异敏感8,其中的 Nefl 是神经丝中最丰富、最易溶解的亚基,在神经元受损时会在轴突部位异常聚集,并释放进入到血液循环中。故血浆中 Nefl 的含量可以动态反映持续的神经元轴索损伤,另据报道6,神经元轴索中 Nefl 表达异常将激活 STAT3 信号通路,也会加重疼痛反应。Nefl 结构与血浆中其他成分有较大区别,有利于通过 ELISA 等免疫学方法检测9。本研究制备了 CCI 模型,该模型能够较为准确地模拟临床中周围神经损伤所引发的神经压迫性疼痛,是慢性疼痛机制研究中最常用的动物模型。首先基于 MWT 测定和蛋白组学分析的方法确定了CCI 组小鼠外周血 Nefl 表达显著升高,是潜在的神221徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(2)经压迫性疼痛生物标志物。随后用 ELISA 方法研究了大鼠 Nefl 血液表达情况与神经压迫性疼痛发生发展的关系,我们发现 CCI 组大鼠血浆中 Nefl 蛋白含量持续增加,与之对应的 MWT 值持续下降,而Sham 组大鼠在术后 1 d 血浆中 Nefl 蛋白含量上升,同时 MWT 下降,而从 3 d 开始逐渐恢复至术前水平。本研究获得的 MWT 变化与经典的 CCI 模型10结果相似,支持米瑞发等11Nefl 表达升高与坐骨神经损伤呈正相关的结论,本实验结果表明单独的坐骨神经暴露手术将对神经元造成短期损伤,血浆Nefl 含量可以反映神经性病理性疼痛的程度。此外,本研究检测了 Nefl 在正常人和 CSR 患者血浆中的含量,并根据疼痛得分和病程对 CSR 患者予以分组。我们发现 CSR 患者血浆中的 Nefl 含量较健康人群上调,支持 Celikbilek 等12神经病变时血液 Nefl 上调的结论。其中 VAS 得分高、病程长的患者血浆 Nefl 含量显著升高,表明血浆 Nefl 含量与CSR 发病和严重程度关系密切。但是,我们也注意到低 VAS 得分和短发病时间的 CSR 患者较健康人群血浆 Nefl 含量存在部分重叠,差异不显著。有文献13指出,Nefl 水平会随年龄持续增高,且男性 Ne-fl 水平高于女性。这可能与这部分 CSR 患者男性比例较高、患者年龄较大有关。我们通过 ROC 曲线分析发现,血浆 Nefl 水平对神经根型颈椎病也具有一定的预测价值。需要注意的是,有文献指出 Nefl还具有稳定神经网络、调节轴突运输、提高髓鞘神经纤维中神经信号传导速度的作用。血浆 Nefl 含量也可以作为吉兰巴雷综合征、帕金森病、多灶性运动神经病、腓骨肌萎缩症等神经系统疾病的生物标志物14-16。因此,当血浆 Nefl 的含量用于诊断时,需要注意排除上述疾病。总而言之,外周血的 Nef 含量可以反映 CSR 疾病进展。参考文献:1 Woods BI,Hilibrand AS.Cervical radiculopathy:epidemiology,etiology,diagnosis,and treatmentJ/OL.J Spinal Disord Tech,2015,28(5):E251-E259.2 MacDowall A,Skeppholm M,Lindhagen L,et al.Effects of preoperative mental distress versus surgical modality,arthroplasty,or fusion on long-term outcome in patients with cervical radiculopathyJ.J Neurosurg Spine,2018,29(4):371-379.3 王昊,李晖,孙振辉,等.神经根型颈椎病、脊髓中央型损伤患者相关颈脊髓神经通路的功能变化J.山东医药,2014,54(3):65-67.4 Laser-Azogui A,Kornreich M,Malka-Gibor E,et al.Neurofilament assembly and function during neuronal developmentJ.Curr Opin Cell Biol,2015,32:92-101.5 Gaetani L,Blennow K,Calabresi P,et al.Neurofilament light chain as a biomarker in neurological disordersJ.J Neurol Neurosurg Psychiatry,2019,90(8):870-881.6 Yang FR,Chen T,Yi H,et al.MicroRNA-7a ameliorates neuropathic pain in a rat model of spinal nerve ligation via the NEFL-dependent STAT3 signaling pathway J/OL.Molecular Pain,2019:2147483647.7 王琪,丛宝华,艾尔肯萨得尔.外周血肿瘤坏死因子 与神经根型颈椎病疼痛程度的相关研究J.新疆医科大学学报,2008,31(9):1249-1250.8 Jarvis JM,Fink EL.Neurofilament light chain-it is not just about concussionsJ.Pediatr Crit Care Med,2020,21(7):685-686.9 Gaiottino J,Norgren N,Dobson R,et al.Increased neurofilament light chain blood levels in neurodegenerative neurological diseasesJ/OL.PLoS One,2013,8(9):e75091.10 梁啸,刘洪美,李庆伟,等.对 SNI 和 CCI 两种大鼠神经病理性疼痛模型的实验观察J.济宁医学院学报,2013,36(1):22-24,27.11 米瑞发,周长满,范明.大鼠坐骨神经损伤后背根节感觉神经元神经丝蛋白基因表达的变化J.解剖学报,2001,32(4):324-328.12 Celikbilek A,Tanik N,Sabah S,et al.Elevated neurofilament light chain(NFL)mRNA levels in prediabetic peripheral neuropathyJ.Mol Biol Rep,2014,41(6):4017-4022.13 Khalil M,Pirpamer L,Hofer E,et al.Serum neurofilament light levels in normal aging and their association with morphologic brain changesJ.Nat Commun,2020,11(1):812.14 Mattsson N,Andreasson U,Zetterberg H,et al.Association of plasma neurofilament light with neurodegeneration in patients with alzheimer diseaseJ.JAMA Neurol,2017,74(5):557-566.15 Mollenhauer B,Dakna M,Kruse N,et al.Validation of serum neurofilament light chain as a biomarker of Parkinsons disease progressionJ.Mov Disord,2020,35(11):1999-2008.16 Halbgebauer S,Steinacker P,Verde F,et al.Comparison of CSF and serum neurofilament light and heavy chain as differential diagnostic biomarkers for ALS J.J Neurol Neurosurg Psychiatry,2022,93(1):68-74.收稿日期:2023-12-04 修回日期:2024-02-05本文编辑:程春开321徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(2)