植物细胞工程的基本技术.doc

2.1.1 植物细胞工程
教学目标
1、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术
2、列举植物细胞工程的实际应用
3、尝试进行植物组织培养
教学重点
1、植物组织培养的原理和过程
2、植物体细胞杂交的原理
3、植物细胞工程应用的实例
教学难点
植物组织培养的实验
教学过程
复习：
细胞分化：
1、概念：在个体发育过程中，由一种或一个细胞通过增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程
注意：不改变细胞数目，不改变遗传，增加了细胞种类
2、原因：相同的基因在特定的时间和空间内进行选择性表达的结果
3、特点：
①普遍性：单细胞生物没有细胞分化
②持久性：细胞分化存在于生物体的整个生命进程中，但在胚胎时期达到最大限度
③不可逆性：分化的细胞要维持分化后的状态直到死亡
4、结果：产生了不同的组织和器官
5、意义：个体发育的基础（包括细胞分裂和细胞分化）
细胞全能性：
1、概念：已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能(起点：细胞、组织、器官；终点：完整个体)
举例：壁虎断尾后再生（×）；皮肤烧伤后再生（×）；种子长成幼苗（√）；植物扦插（√）；
受精卵发育成婴儿（√）；
2、物质基础：每个细胞里有该种生物全套的遗传信息（所以单个卵细胞或精子也可发育成完整个体，体现全能性）
3、条件：①离体 ②营养物质 ③外界条件
4、发挥顺序
植物细胞》动物细胞
受精卵＞生殖细胞（卵＞精子）＞体细胞
体细胞：分裂能力强的细胞＞分裂能力弱的细胞（分化程度低＞分化程度高）
注意：①受精卵是未分化的细胞，所以全能性最高
②生殖细胞是分化程度高，全能性也高（特例）

细胞工程：是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。
分类：植物细胞工程和动物细胞工程
一、植物组织培养
1、理论基础：植物细胞全能性
2、流程：
再分化
脱分化
离体的植物细胞、
组织或器官（外植体）

植株
试管苗
根、芽或胚状体
愈伤组织

未分化
已分化

相关知识点：
①取材：根尖、茎尖、芽尖等分生组织，分裂能力强，全能性易发挥
②脱分化（诱导培养基） 实质：使细胞恢复分裂能力
a．概念：让已经分化的细胞经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化的细胞的过程
形式：固体
b．培养基 无机物：水、无机盐
成分 有机物：氨基酸、维生素、蔗糖
植物激素：生长素和细胞分裂素
注：培养基中加入蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压
另外，脱分化培养基上可加入2,4－D，促进愈伤组织的产生和生长
c．条件：黑暗（因为在光照条件下容易分化成维管组织，不利于产生大量的愈伤组织）
无菌（一旦污染，迅速生长的各种杂菌不仅会与培养物争夺营养，而且杂菌会产生大量对培养物有害的物质，导致培养物死亡）
消毒和灭菌的区别
第一，两者要求达到的处理水平不同。消毒只要求杀灭或清除致病微生物，使其数量减少到不再能引起人发病。灭菌不仅要求杀灭或/和清除致病微生物，还要求将所有微生物全部杀灭或/和清除掉，包括非致病微生物。总之，消毒只要求场所与物品达到无害化水平，而灭菌则要求达到没有一个活菌存在。
第二，两者选用的处理方法不同。灭菌与消毒相比，要求更高，处理更难。灭菌必须选用能杀灭抵抗力最强的微生物（细菌芽孢）的物理方法或化学灭菌剂，而消毒只需选用具有一定杀菌效力的物理方法、化学消毒剂或生物消毒剂。将灭菌的处理方法用于消毒不仅是杀鸡用牛刀没有必要，而且还会产生本来可以不发生的副作用；而如果将消毒的处理方法用于灭菌，将会导致灭菌失败。
第三，应用的场所与处理的物品也不同。灭菌主要用于处理医院中进入人体无菌组织器官的诊疗用品和需要灭菌的工业产品，消毒用于处理日常生活和工作场所的物品，也用于医院中一般场所与物品的处理。

③愈伤组织：排列疏松，高度液泡化的无定形状态的薄壁细胞。（分化程度低，全能性高）
④再分化（分化培养基） 实质：基因的选择性表达
a．概念：脱分化产生的愈伤组织继续培养又可以重新分化成根或芽等器官的过程
b．培养基：同脱分化培养基
c．条件：光照（有利于诱导形成叶绿素）
⑤植物激素的使用对植物组织培养的影响
生长素
细胞分裂素
高→有利于根的形成
a．使用比例： 低→有利于芽的分化
适中→促进愈伤组织的形成
先生长素后细胞分裂素：有利于细胞分裂，但不分化
b．使用顺序 先细胞分裂素后生长素：细胞既分裂又分化

同时使用两种激素：分化频率提高
3、概念：在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织或细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整植株。
二、植物体细胞杂交
1、理论基础：①植物原生质体融合：生物膜具有一定的流动性
②植物组织培养：植物细胞的全能性
2、流程：
植物细胞A 植物细胞B
植物的原生质体融合
去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体
原生质体A 原生质体B

人工诱 导融合

杂种原生质体AB
再生出 细胞壁

杂种细胞
植物组织培养
脱分化

愈伤组织
再分化

杂种植株
相关知识点：
①去壁原因：细胞壁阻碍了原生质体的融合
去壁方法：酶解法（纤维酶和果胶酶）
②诱导融合的方法
物理：离心、振动、电激等 化学：聚乙二醇（PEG）
③融合的实质：核融合
④融合完成的标志：杂种细胞再生出细胞壁
⑤再生细胞壁涉及到的细胞器：高尔基体、线粒体
注意：①进行杂交的细胞是不同种生物的细胞，因为不同物种之间存在生殖隔离，用杂交的方式不能获得
②杂种植株体细胞内的染色体组数是融合前两细胞内染色体组数之和
③杂种植株是否可育取决于融合前植株的育性
原因：减数分裂（不）正常，（不）能形成正常配子
④杂种植株融合过程中细胞中遗传物质的传递不遵循孟德尔遗传规律
3、概念：将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术
4、优点：克服不同生物远缘杂交不亲和障碍
拓展：植物体细胞杂交尚存在一些问题
①亲缘关系越远，染色体排斥丢失的现象越严重
②由于是两个物种的全部遗传物质的合并，各种基因都在其中，选择符合需要的个体的难度大
③有时缺乏选择杂种细胞的有效方法
因此目前整体对称融合的工作比较少，而是采用非对称融合，即一方亲本包括了全部遗传物质，另一方亲本只取一部分遗传物质，如用不具有细胞核的原生质体与之进行融合

小知识：植物细胞是如何吸收蔗糖的？
1、植物细胞是如何吸收蔗糖的？
在植物组织培养初期，由于植物组织或细胞不能进行光合作用，因此需要供给碳源和能源。由于受教材中质壁分离和复原实验的影响，人们会认为蔗糖不能被植物细胞吸收，其实它是可以进入的。在培养基中蔗糖浓度较低，蔗糖以被动运输的形式进入细胞，植物细胞内有蔗糖转化酶，在高等植物蔗糖代谢中起着很重要的作用。培养基中添加蔗糖而不是葡萄糖，是以大量实验为基础的，实验表明蔗糖能支持绝大多数植物离体培养物的旺盛生长，原因可能有：①同样作为碳源和能源物质，蔗糖较葡萄能更好地维持培养基内的低渗环境。②防止微生物的污染，微生物生长所需的碳源最适合的是葡萄糖。③相同的物质的量浓度下，蔗糖比葡萄糖提供的能量多。当然，不同植物对不同糖类的反应是不完全的。
2、疑问：植物组织培养的培养基为什么只用蔗糖而不用葡萄糖？
植物与动物的最大差别就是植物是自养型的（光合作用），而动物是异养型的（外部吸收代谢）。植物光合产物是多糖（二碳糖以上，包括蔗糖），贮藏产物形式是淀粉，而淀粉的合成前体就是蔗糖。蔗糖=葡萄糖+果糖，所以蔗糖的合成必须同时要有葡萄糖和果糖，其实植物也只能吸收葡萄糖和果糖。在组织培养中加入蔗糖，经熬煮和高压灭菌后就会分解成植物能够吸收的葡萄糖和果糖形式。其实这样看来在组培中，植物也有部分异养的特点，如果在培养基中缺少任何一种糖的形式，植物在自养能力（光合、呼吸、产物代谢等）较差的情况下，就难免会影响其生理代谢。与植物不同的，动物是异养型的，它不需要淀粉的积累，也没光合作用，动物细胞本身所处的生理环境和代谢方式就决定了它对糖形式的要求了。蔗糖还是植物组织培养过程细胞分化的条件之一。

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