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丁苯酞通过下调NF-κB信...减轻大鼠肾缺血-再灌注损伤_张瑞波.pdf
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1、第 14 卷 第 4 期2023 年 7 月Vol.14 No.4Jul.2023器官移植Organ Transplantation论著丁苯酞通过下调NF-B信号通路抑制细胞焦亡减轻大鼠肾缺血-再灌注损伤张瑞波申开文王强袁强沈俊【摘要】目的 探讨丁苯酞对大鼠肾缺血-再灌注损伤(IRI)的作用机制。方法 将 40 只 SD 大鼠随机分为假手术组(Sham 组)、模型组(IRI 组)、NF-B 抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)组、丁苯酞低剂量组(NBP-L 组)及丁苯酞高剂量组(NBP-H 组),每组 8 只。检测各组大鼠血清肌酐(Scr)、血清胱抑素 C(Cys-C)、血尿素氮(BUN)
2、和血清白细胞介素(IL)-1、IL-18 水平,苏木素-伊红(HE)染色观察各组肾组织病理损伤情况,采用蛋白质印迹法和免疫组织化学法检测肾组织中炎症因子、核因子(NF)-B 信号通路及细胞焦亡相关蛋白表达水平。结果 与 Sham 组比较,IRI 组肾组织损伤较为严重,Scr、Cys-C、BUN 和血清IL-1、IL-18 水平均升高,蛋白质印迹法结果显示 NOD 样受体蛋白(NLRP3)、Gasdermin D(GSDMD)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1、IL-18、IL-1、NF-B p65、p-NF-B p65 蛋白相对表达量均增加,免疫组织化学染色结果显示 NF-B p6
3、5、p-NF-B p65、IL-1、IL-18 和 NLRP3 蛋白表达均增多。与 IRI 组比较,PDTC 组、NBP-L 组和 NBP-H 组肾组织的损伤程度均减轻,Scr、Cys-C、BUN 和血清 IL-18、IL-1 水平均下降,蛋白质印迹法结果显示 NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-1、IL-18、NF-B p65、p-NF-B p65 蛋白表达DOI:10.3969/j.issn.1674-7445.2023.04.010基金项目:贵州省卫生健康委科学技术基金(gzwkj2021-220);国家自然科学基金培育项目 gyfynsfc(2020)-30;贵州医科大学
4、附属医院 2022 年博士科研启动基金(gyfybsky-2022-31)作者单位:550004 贵阳,贵州医科大学附属医院泌尿外科作者简介:张瑞波(ORCID:0009-0009-3056-7298),硕士研究生,肾移植相关缺血-再灌注损伤与保护,Email:通信作者:沈俊(ORCID:0000-0003-1208-5833),博士,副主任医师,肾移植相关缺血-再灌注损伤与保护,Email:结构式摘要HE 染色观察肾组织病理学改变免疫组化染色检测炎症因子、NF-B 信号通路及细胞 焦亡相关蛋白IRISham 组IRI 组PDTC 组NBP-H 组丁苯酞或 PTDC 或 0.9%氯化钠注射液N
5、BP-L 组蛋白质印迹法检测炎症因子、NF-B 信号通路及细胞 焦亡相关蛋白Scr、BUN、Cys-C 水平检测IL-1、IL-18 水平检测540第 14 卷器官移植肾 脏 缺 血-再 灌 注 损 伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)通常由器官移植、肾部分切除手术、败血症等引起,如不及时采取有效措施加以预防,很容易发展为急性肾损伤,导致病死率上升1-6。肾 IRI【Abstract】Objective To elucidate the mechanism of dl-3-N-butylphthalide(NBP)on renal ischemia-reperf
6、usion injury(IRI)in rat models.Methods Forty SD rats were randomly divided into the sham operation group(Sham group),model group(IRI group),NF-B inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate group(PDTC group),low-dose NBP group(NBP-L group)and high-dose NBP group(NBP-H group),with 8 rats in each group.Serum
7、 creatinine(Scr),serum cystatin C(Cys-C),blood urea nitrogen(BUN)and serum interleukin(IL)-1 and IL-18 levels were detected in all groups.Pathological injury of renal tissues in each group was observed by Hematoxylin-eosin(HE)staining.The expression levels of inflammatory factors and nuclear factor(
8、NF)-B signaling pathway and cell pyroptosis-related proteins in renal tissues were measured by Western blot and immunohistochemical staining.Results Compared with the Sham group,renal tissue injury was more severe,and the levels of Scr,Cys-C,BUN and serum IL-1 and IL-18 were all up-regulated in the
9、IRI group.Western blot showed that the relative expression levels of NOD-like receptor protein(NLRP3),Gasdermin D(GSDMD),cysteinyl aspartate specific proteinase(Caspase)-1,IL-18,IL-1,NF-B p65 and p-NF-B p65 proteins were all up-regulated,and immunohistochemical staining revealed that the expression
10、levels of NF-B p65 and p-NF-B p65,IL-1,IL-18 and NLRP3 proteins were all up-regulated in the IRI group.Compared with the IRI group,renal tissue injury was alleviated,and the levels of Scr,Cys-C,BUN and serum IL-18 and IL-1 were down-regulated in the PDTC,NBP-L and NBP-H groups.Western blot showed th
11、at the expression levels of NLRP3,GSDMD,Caspase-1,IL-1,IL-18,NF-B p65 and p-NF-B p65 proteins were down-regulated,and immunohistochemical staining indicated that the expression levels of NF-B p65,p-NF-B p65,IL-1,IL-18 and NLRP3 proteins were down-regulated in the PDTC,NBP-L and NBP-H groups,respecti
12、vely.Compared with the NBP-L group,renal tissue injury was mitigated,and the levels of Scr,Cys-C,BUN,serum IL-18 and IL-1 were all down-regulated in the NBP-H group.Western blot showed the expression levels of NLRP3,GSDMD,Caspase-1,IL-1,IL-18,NF-B p65 and p-NF-B p65 proteins were down-regulated in t
13、he NBP-H group.Immunohistochemical staining indicated that the expression levels of NF-B p65,p-NF-B p65,IL-1,IL-18 and NLRP3 proteins were down-regulated in the NBP-H group.Conclusions NBP may down-regulate the activity of NF-B/NLRP3 signaling pathway and reduce the expression levels of cell pyropto
14、sis-related proteins and inflammatory factors after renal IRI,thereby suppressing cell pyroptosis and alleviating renal IRI.【Key words】Dl-3-N-butylphthalide;Ischemia-reperfusion injury;Acute renal injury;Cell pyroptosis;Inflammation;NOD-like receptor protein 3(NLRP 3);Serum creatinine;Blood urea nit
15、rogen;Nuclear factor(NF)-B signaling pathway;Serum cystatin C(Cys-C);Interleukin-1;Interleukin-18均减少,免疫组织化学染色结果显示 NF-B p65、p-NF-B p65、IL-1、IL-18 和 NLRP3 蛋白表达均下降。与NBP-L 组比较,NBP-H 组肾组织的损伤程度减轻,Scr、Cys-C、BUN 和血清 IL-18、IL-1 水平均下降,蛋白质印迹法结果显示 NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-1、IL-18、NF-B p65、p-NF-B p65 蛋白表达均减少,免疫组
16、织化学染色结果显示 NF-B p65、p-NF-B p65、IL-1、IL-18 和 NLRP3 蛋白表达均下降。结论 丁苯酞可下调 NF-B/NLRP3 信号通路的活性,降低肾 IRI 后焦亡相关蛋白的表达水平及炎症因子水平,进而抑制细胞焦亡,减轻肾 IRI。【关键词】丁苯酞;缺血-再灌注损伤;急性肾损伤;细胞焦亡;炎症;NOD 样受体蛋白 3(NLRP3);血清肌酐;血尿素氮;核因子(NF)-B 信号通路;血清胱抑素 C(Cys-C);白细胞介素-1;白细胞介素-18【中图分类号】R617,R816.8【文献标志码】A【文章编号】1674-7445(2023)04-0010-08Dl-3-
17、N-butylphthalide alleviates renal ischemia-reperfusion injury by down-regulating NF-B signaling pathway and inhibiting cell pyroptosis in rat models Zhang Ruibo,Shen Kaiwen,Wang Qiang,Yuan Qiang,Shen Jun.Department of Urology Surgery,the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 5500
18、04,China Corresponding author:Shen Jun,Email:张瑞波等丁苯酞通过下调NF-B信号通路抑制细胞焦亡减轻大鼠肾缺血-再灌注损伤第 4 期541的发生发展可能通过炎症相关信号通路介导炎症反应,而阻断炎症反应在改善急性肾损伤病理状态中起着非常重要的作用4-5,7。有关研究表明,细胞焦亡是肾 IRI 的关键机制3。细胞焦亡是炎症相关的程序性细胞坏死,在受到损伤刺激后,NOD 样受体蛋白 3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体被激活,进而促进炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-1和 IL-18 释放8-9
19、。丁苯酞不仅具有抗炎症反应的作用,还参与抗氧化应激,具有促血管生成的作用,此外对血脑屏障的功能也具有保护作用10-11。研究表明,丁苯酞可以减轻炎症、防治细胞焦亡引起的炎性损伤、改善微循环等,对心、脑等组织的 IRI 具有很好的预防作用12-15。丁苯酞在肾 IRI 的作用机制尚未明确,本研究拟探讨丁苯酞在大鼠肾 IRI 中的作用及其机制。1 材料与方法1.1 实验动物与试剂无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级雄性 SD 大鼠 40 只,体质量 190210 g,购于辽宁长生生物技术股份有限公司,饲养于贵州医科大学临床实验动物中心,并经贵州医科大学动物伦理委员
20、会批准 审批号:SCXK(辽)2020-0001。丁苯酞、核因子(nuclear factor,NF)-B 抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)购于贵州明涵生物科技有限公司,苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染液购于武汉阿斯本生物技术有限公司,血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,Scr)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所,血清胱抑素C(serum cystatin C,Cys-C)、IL-1 和 IL-18 检测试剂盒购于科鹿(武汉)生物科技有
21、限责任公司。蛋白质印迹抗 体:NLRP3、Gasdermin D(GSDMD)、IL-1 一抗购于英国 Abcam 公司,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)-1 一抗购于江苏亲科生物研究中心有限公司,NF-B p65和 p-NF-B p65 一抗购于美国 CST 公司,二抗均购于武汉阿斯本生物技术有限公司。免疫组织化学(免疫组化)抗体:IL-18 一抗购于武汉三鹰生物技术有限公司,IL-1 一抗购于美国 Affinity 公司,NF-B p65、NLRP3 一抗购于美国 Novus 公司,p-NF-B p65
22、一抗购于英国 Abcam 公司,二抗均购于武汉塞维尔生物科技有限公司。1.2 实验分组与建模将 40 只 SD 大鼠通过简单随机抽样分为 5 组,分别为假手术组(Sham 组)、模型组(IRI)组、PDTC 组、丁苯酞低剂量组(NBP-L 组)和丁苯酞高剂量组(NBP-H 组),每组各 8 只。大鼠术前禁食1012 h,术前 2 h,PDTC 组大鼠腹腔注射 100 mg/kg PDTC,NBP-L 组和 NBP-H 组大鼠腹腔注入丁苯酞注射液,剂量分别为 3 mg/kg 和 6 mg/kg,Sham 组和IRI 组大鼠注入相同剂量的 0.9%氯化钠注射液。腹腔注射 3%戊巴比妥钠(50 mg
23、/kg)进行麻醉后,以腹中线为标志,剪开腹部并暴露腹腔,对肠腔进行钝性分离至双侧肾蒂显露。IRI 组、PDTC 组、NBP-L 组和 NBP-H 组用微型动脉夹对肾蒂予夹闭处理,45 min 后松开夹子。Sham 组仅钝性分离肠腔并显露双侧肾蒂,不予夹闭。术闭缝合腹部切口后继续喂养 24 h,之后利用同样方式麻醉并处死大鼠,收集血液及双侧肾脏组织进行后续实验。1.3 实验方法1.3.1 BUN 和 Scr 水平检测 采用试剂盒检测各组大鼠的 BUN、Scr 水平。1.3.2 酶联免疫吸附试验检测 IL-1、IL-18、Cys-C水平 采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immun
24、e absorbent assay,ELISA)试剂盒检测各组大鼠的血清IL-1、IL-18、Cys-C 水平。1.3.3 HE 染色观察肾组织病理学改变 肾组织标本采用 4%多聚甲醛保存并固定 24 h 后,放入标记好的包埋框内,石蜡切片经过脱蜡水洗后,进行 HE 染色,最后使用中性树胶将组织封片。1.3.4 免疫组化染色检测炎症因子、NF-B 信号通路及焦亡相关蛋白 肾组织石蜡切片脱蜡并水洗,修复抗原后用稀释的一抗(NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1、NF-B p65、p-NF-B p65)覆盖切片置于 4 的冰箱孵育过夜,之后 用 二 抗 进 行 孵 育,使
25、 用 3,3-二 氨 基 联 苯 胺(3,3-diaminobenzidine,DAB)染色,苏木素染核,最后使用中性树胶对组织封片。显微镜下观察,当胞核或胞质出现黄褐色时即为阳性染色。1.3.5 蛋白质印迹法检测炎症因子、NF-B 信号通路及焦亡相关蛋白 提取蛋白,通过制胶、电泳、转模等步骤后,把稀释的一抗(NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1、NF-B p65、p-NF-B 542第 14 卷器官移植p65)和聚偏氟乙烯膜一起放入盒中,4 过夜,洗涤后加入二抗稀释液于室温下孵育 30 min,随后行化学发光检测。1.4 统计学方法 采用 GraphPad Pri
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