土鸡肠道产消化酶细菌的研究-本科毕业论文.doc
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1、12株信鸽分离菌产脂肪酶初步研究本科生毕业论文(设计)题 目: 土鸡肠道产消化 酶细菌的研究 学生姓名: 陈旭斌 学 号: 201013010310 专业班级: 生科 10103 指导教师: 李娜 完成时间: 2014年4月30日 目 录摘要1Abstract11绪论21.1信鸽21.2脂肪酶的概述21.3脂肪酶的研究进展21.4信鸽分离菌产脂肪酶的研究意义32实验材料32.1实验原料32.2药品和试剂32.3实验用品32.4主要设备及仪器33实验方法43.1分离计数的过程43.1.1鸽肝、鸽肺稀释液的制备43.2 菌落特征观察的过程53.2.1、观察倍比稀释后平板中长出的菌落特征。53.2.
2、2细菌和酵母菌菌落的观察和识别53.2.3菌落归类5将记录好的带有编号的未知菌落的各项特征,结合各类微生物特点的,分别了解各菌株的外貌特征并归入相应的大类中。53.3四区划线的过程63.3.1、试管斜面划线63.3.2、平板的四区划线63.4革兰氏染色的方法73.5产脂肪酶能力检测的过程84实验结果84.1分离计数的结果84.2菌落特征观察104.3四区划线的结果124.4革兰氏染色结果124.5产脂肪酶能力检测结果165 讨论与小结17参考文献20致谢2112株信鸽分离菌产脂肪酶能力初步研究摘要以信鸽的肝、肺为材料,分离出细菌12株。通过革兰氏染色结果表明:9株为革兰氏阴性菌,3株为革兰氏阳
3、性菌。对它们的产脂肪酶能力进行研究,结果表明12株信鸽分离菌产脂肪酶菌株共6株,占总菌株数的50%,其中鸽肝5株、鸽肺1株。产脂肪酶能力最强的是肝4,水解圈与菌落直径比为4.5。关键词:鸽肝; 鸽肺; 脂肪酶; 分离菌。Preliminary study of Twele pigeons isolated bacteria to produce lipase ability AbstractUsing the pigeons liver and lungs as material to separation of bacteria 30 strains.Gram staining result
4、s showed that 24 strains of gram-negative bacteria, 6 strains of gram-positive bacteria. And amylase the ability of lipase .Results show that this experiment from in liver and lungs 30 strains of bacteria were isolated from pigeons , 6 strains producing lipase, accounting for 50% of the total, inclu
5、ding 5strains is from liver and 1strains is from lung. Among them one of the best is liver 4that ability of producting lipase, hydrolysis and colony diameter ratio of 4.5.Key words :pigeon liver ; pigeon lung; lipase; isolate.1绪论1.1信鸽鸽是鸽形目鸠鸽科数百种鸟类的统称。鸽属,学名Columba,是鸠鸽科的一属,俗称鸽子;包括各种小型中型和大型的鸽子,其中有我们今天常
6、见的鸽子,即原鸽。是一种善于飞行的鸟,品种很多,羽毛的颜色也多,主要以谷类为食。鸽子翅长,飞行肌肉强大,故飞行迅速而有力。鸽栖息在高大建筑物上或山岩峭壁上,常数十只结群活动,飞行速度较快,飞行高度较低。在地上或树上觅食种子和果实。在山崖岩缝中用干草和小枝条筑巢。巢平盘状,中央稍凹,一般每窝产卵2枚。卵白色。一年可以产卵5-8对。家鸽就是由原鸽驯化的。从众多的各具特点的野生原鸽,进化到多种多样的家鸽,说明今天的家鸽是一种多源性的产物。1.2脂肪酶的概述脂肪酶(lipase),又称甘油酯水解酶,是一类广泛存在于微生物及动植物细胞中的特殊酯键水解酶,可以催化水解甘油三酯、单甘脂、甘油及游离脂肪酸。在
7、油水界面上还能催化脂化、转酯化、甘油解和氨解等多种反应。脂肪酶参于的生化反应条件较缓和、副产物少的优点,反应通常具有高度的立体异构专一性和化学选择性。对环境污染小,成本低。因此广泛运用于食品粮油、精细化工、生物能源、环境保护医疗防治以及分子生物学研究等方面。1.3脂肪酶的研究进展脂肪酶是科研研究中最早被关注的酶类之一,已经有100多年的历史了。自然界中脂肪酶是广泛存在的,特别是微生物和动植物的组织中。微生物产脂肪酶有种类繁多、不被季节气候等环境条件的因素所影响、产酶时间短,发酵产物比较单一等优点。因此,脂肪酶的研究具有很高的应用价值。近年来越来越得到各国科研人员的广泛注意,在理论上的发展非常迅
8、速,极大的带动了脂肪酶在工业生产实际中的应用。1.4信鸽分离菌产脂肪酶的研究意义脂肪酶的研究具有很高的应用价值,我们对多种微生物产脂肪酶也有了一定了解,但由于脂肪酶生产条件较为复杂,成本较高,所以使得动物脂肪酶的研究也慢慢提上舞台。到目前为止,对动物脂肪酶来说,在脂肪酶产生菌的筛选及产脂肪酶能力的研究还比较慢,所以了解不同生物细菌产脂肪酶能力是至关重要的。本实验就是以信鸽的肝和肺为材料初步了解信鸽分离菌产脂肪酶能力。2实验材料2.1实验原料本研究所采用的原料有:信鸽的肺、肝。2.2药品和试剂10%盐酸溶液、无菌水、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、酵母粉、氯化钙、吐温-80、10%NaOH、结晶
9、紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红、复红、二甲苯、香柏油。2.3实验用品牛角勺、研钵、玻璃棒、pH试纸、衣棉、烧杯、平板、试管、1000mL刻度搪瓷杯、标签纸、纱布、1mL无菌吸管、记号笔、酒精灯、试管架、锥形瓶、打火机、接种环、牙签、报纸、棉线、载玻片、盖玻片、镊子、1mL移液管等基本实验用品,枯草杆菌,大肠杆菌。2.4主要设备及仪器电子分析天平、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、电子显微镜、恒温箱、干燥箱。 3实验方法3.1分离计数的过程3.1.1鸽肝、鸽肺稀释液的制备 1、取鸽肝、鸽肺样品 取拉稀信鸽新鲜鸽肝、鸽肺样品,放入4摄氏度的冰箱中暂存。 2、培养基的制备 成分:牛肉膏5.0g、蛋白胨1
10、0.0g、NaCl 5.0g、琼脂20.0g、自来水1000mL、pH7.0。 配好后分装入锥形瓶中,用报纸包扎好后,再放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌。制好备用。 3、样品稀释液的制备 分别准确称取待测样品各10g,用剪刀剪碎,再放入研钵中充分研磨,直到样品变成糊状,再用无菌吸管吸取糊状鸽肝1mL放入装有9mL无菌水的试管中,即成10-1稀释液;吹吸3次,让菌液混合均匀,再用1mL无菌吸管,吸取10-1稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中,即成10-2稀释液;以此类推,连续稀释,制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等一系列稀释液。鸽肺同法。 用稀释平板计数时
11、,采用10-5、10-6、10-7稀释度。 4、平板接种培养(涂抹平板计数法) 先将培养基溶化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,将无菌平板编上,肝10-5、肝10-6、肝10-7号码,每一号码设置3个重复,用无菌吸管按无菌吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀,每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度是需要将刮铲灼烧灭菌。将涂抹好的平板平放于桌上20min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养,至菌落长出后即可计数。计算结果时,从接种后的3个稀释度中选择一个合适的的稀释度。求出每克菌剂中的含菌数。鸽肺方法同上。3.2 菌落特征观察的过
12、程3.2.1、观察倍比稀释后平板中长出的菌落特征。 仔细观察平板中的菌落,并记录好菌落大小、形成方式、表面形态、边缘干湿、颜色、光泽、厚度以及透明度等特征。3.2.2细菌和酵母菌菌落的观察和识别 细菌和酵母菌都是单细胞微生物,菌落由菌体堆积而成,有共同的特征,较湿润、光滑、透明、易挑起、菌落的正反面、边缘和中央颜色一致,质地较均匀。但两者也有区别,细菌的菌落较小、较薄、较湿润、颜色多样,较有“细腻”感。有鞭毛的细菌其菌落较扁平、边缘不规则。有芽孢的细菌菌落粗糙、多皱、不透明。酵母菌的菌落比细菌的大、厚、外观较稠、较不透明。 放线菌与霉菌菌落的观察 放线菌和霉菌的菌落都呈丝状,在固体培养基上都有
13、基内菌丝和气生菌丝的分化,因此菌落由菌丝相互缠结而成、外观干燥、不透明,呈蛛丝状或绒毛状,菌落与培养基结合紧密不易挑起。菌落、孢子常分泌不同色素,使菌落的正反面、中央和边缘表现不同的颜色。两者也有区别:放线菌菌丝比霉菌菌丝细,生长后期 分化的 孢子丝有大量的孢子,因而它的孢子比霉菌小儿密,表面呈干粉状,霉菌的菌丝比放线菌粗长,菌丝快而疏松。3.2.3菌落归类将记录好的带有编号的未知菌落的各项特征,结合各类微生物特点的,分别了解各菌株的外貌特征并归入相应的大类中。3.3四区划线的过程3.3.1、试管斜面划线 将装有牛肉膏蛋白胨的试管斜面编号肺2,肺4,肝1,肝2,肝3,肝4,肝5,肝6,肝7,肝
14、8,肝9,肝10。再用接种环挑选鸽肝平板接种后的板中的小个的菌落,在标有鸽肝1的牛肉膏蛋白胨试管斜面划“之”字形,再接着挑鸽肝平板接种后的板中的小个的菌落,在标有鸽肝2的牛肉膏蛋白胨试管斜面划“之”字形,依次如此,鸽肺试管中的菌要从鸽肺的平板中挑选菌。待试管全部划完后,再放入37的恒温培养箱中培养24h。3.3.2、平板的四区划线平板的四区划线分离法是指把微生物群体用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞,经培养后生长繁殖成单个菌落,以达到保种所需要的纯度。实验步骤:1、 先倒好营养琼脂的培养基平板冷却待用。2、 做分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面
15、积不等的区域。各区域之间的交角为120左右(平板转动一定角度约60),以便充分利用整个平板的面积,而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行,并可避免两区线条相接触。3、 划线操作 (1)挑取含菌样品:用灭菌好的接种环,挑取少量肝1试管斜面上的菌种 (2)划A线:将平板置于酒精灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板平行于桌面有培养基一面向着酒精灯,右手拿接种环先在A区划3条连续的平行线,画完A区后立即烧掉接种环上残菌, (3)划其他区:使B区转到上方,并将将冷却好的无菌的接种环通过A区(菌源区)将军菌带到B区,随即划出3条致密的平行线,再从B区做C区的划线,最后做C区到D区的划线,D区的线条应与
16、A区平行,但不能与A、B区接触,随即将皿底放入皿盖中,烧去接种环上的残菌。 (4)恒温培养:将划线平板倒置,于37恒温箱中培养,24h后观察。 (5)其他试管斜面也依次进行此操作。3.4革兰氏染色的方法3.4.1活化准备 由于四区划线已将细菌分离纯化了,挑选纯化后的细菌于试管进行平板活化,再从活化后的平板中的菌中,挑菌进行试管活化。备用。3.4.2革兰氏染色步骤 1、涂片:用消毒棉球擦拭双手,用镊子取干净载玻片两块,在一块载玻片的左、右两侧各加一滴蒸馏水,另一载玻的中央滴一滴蒸馏水,片按无菌操作法取菌涂片,前一块玻片的左边涂枯草杆菌,右边涂大肠杆菌,后块玻片的中央涂我们活化在试管内的鸽肝1菌种
17、,做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块,在该玻片的左、中、右三处分别滴加一滴蒸馏水,挑刚制成的枯草杆菌悬液2-3环涂在左边制成薄的涂面,鸽肝1内菌的浓液2-3环涂在中间制成薄涂片,将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂片面。 2、晾干:让涂片在酒精灯上方用文火烘干。 3、固定:手执玻片一端,让菌膜朝上,通过火焰2-3次固定,以不烫手为宜。 4、结晶紫出染色:将玻片置于废液缸搁架上,加适量的结晶紫染色液染色1分钟,以盖满细菌涂面为宜。之后顷去染色液。用水小心地冲洗。 5、典液媒染:滴加卢哥氏典液,媒染1分钟后用水洗去典液。 6、脱色:将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇,脱色18-20秒至流出液无色
18、,立即水洗。 7、复染:滴加蕃红复染2-5分钟,然后用水洗去涂片上的蕃红染色液。 8、晾干:将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 9、镜检:镜检时,先低倍再高倍,最后用油镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应性。 10、其他11株菌依次进行该操作。 11、实验完毕后,打扫实验台。3.5产脂肪酶能力检测的过程3.5.1培养基制备 成分:蛋白胨5.0g、酵母粉1g、氯化钙 0.1g、琼脂15.0g、氯化钠5.0g、吐温-80为5mL、自来水1000mL、pH7.2。 配好后分装入锥形瓶中,用报纸包扎好后,再放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌。制好备用。 将装有配好的脂肪酶培养基的三角瓶置于微波炉中溶化,分
19、别倒入四个无菌平皿中,待凝固成平板后,用标记笔在那些平板的底部划四区,用写有对应试管编号的标签纸,分别贴在那些四区内。3.5.2接种(点接种方法)用灭菌好的牙签,从活化了的菌的试管中挑取菌种,接种于对应试管编号的平板区域内,接种完后放入37摄氏度的恒温箱中培养。4实验结果4.1分离计数的结果 将鸽肺、鸽肝进行初步处理,研磨成浆作为菌源之后,接着倍比稀释,然后再涂布到平板上。培养一段时间后,在培养基上可以观察到很多个菌落。由此,可进行计数,得到以下结果。肝图1:稀释平板测数结果Figure 1:Dilution plate count results表1:稀释平板测数结果Table 1 Dilu
20、tion plate count results平板序号稀释度菌落数1g样品平均活菌数110-7212.55108210-7242.55108310-7302.55108肺图2: 稀释平板测数结果Figure2:Dilution plate count results表2:稀释平板测数结果Table 2 Dilution plate count results平板序号稀释度菌落数1g样品平均活菌数110-7262.3107210-7182.3107310-7252.31074.2菌落特征观察将倍比稀释后涂板的菌放入37培养箱中培养24h后,观察到分离所得的菌落大小不一,但是形成方式、表面形态、
21、边缘干湿,颜色、光泽、厚度、透明度大致相同,都表现为细菌的形态特征。具体结果如下:肝表3:微生物菌落形态特征记录Table 3. The records of microorganism morphology characteristics 菌名或编号大小(mm)形成方式表面形态边缘干湿颜色光泽厚度透明度15细胞堆积光滑整齐较湿润乳白色有较薄半透明27细胞堆积光滑整齐较湿润乳白色有较薄半透明34细胞堆积光滑整齐较湿润乳白色有较薄半透明42细胞堆积光滑整齐较湿润乳白色有较薄半透明55细胞堆积光滑整齐较湿润乳白色有较薄半透明63细胞堆积光滑整齐较湿润乳白色有较薄半透明75细胞堆积光滑整齐较湿润乳白
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