抗沉默功能蛋白1B在幽门螺杆菌感染的人胃癌细胞中的表达及其对AGS细胞株增殖和转移能力的影响.pdf
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1、58 消化肿瘤杂志电子版2024年3月第16卷第1期J Dig Oncol(Electronic Version).March 2024.Vol 16.No.I 抗沉默功能蛋白1B在幽门螺杆菌感染的人胃癌细胞中的表达及其对AGS细胞株增殖和转移能力的影响蔡育志,高剑,黄永业,刘丁一,廖海华,张彤广州市番禺区中心医院消化中心,广东广州511400【摘要】目的检测组蛋白伴侣抗沉默功能蛋白1B(anti-silencing functional protein lB,ASFlB)在胃癌组织中的表达情况及其与胃癌患者预后之间的关系,探讨ASFlB对人胃癌细胞株ACS增殖、转移能力的影响以及可能的分子机
2、制,分析ASFlB与幽门螺杆菌感染之间的关系。方法分析癌症基因组图谱数据库中泛瘤种的肿瘤组织和癌旁正常组织中ASFlB的表达情况,并通过实时荧光定量聚合酶链反应(realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测ASFlB在所收集的59例配对的胃癌组织及癌旁正常组织中的mRNA表达水平。分析Kaplan-Meier plotter数据库中胃癌患者ASFIB的表达水平与其预后之间的关系,后通过免疫组织化学检测胃癌组织芯片中ASFlB的表达水平并分析其与胃癌患者临床预后及临床病理参数之间的关系。通过小于扰RN
3、A(small interfering RNA,siRNA)技术敲低胃癌细胞系ACS中的ASFIB表达,分组为siNC组(阴性对照转染细胞)、siASFlB#l组、siASFlB#2组及siASFlB#3组,后采用CCK-8、平板单克隆实验、Transwell小室迁移实验检测各组细胞的增殖、转移能力。分析基因表达综合数据库的数据集GSE27411中幽门螺杆菌阳性和阴性的胃癌组织中ASFlB的表达水平,并通过RT-qPCR及蛋白质印迹法检测ASFlB在幽门螺杆菌感染前后的胃癌细胞系ACS中的表达水平。结果相关数据库及我们的胃癌队列中的胃癌组织ASFlB的mRNA和蛋白表达水平均高于癌旁正常组织,
4、且胃癌组织中高表达的ASFlB与胃癌患者不良预后相关。此外,与siNC组相比,敲低ASFlB组(siASFlB#l组、siASFlB#2组及siASFlB#3组)的细胞增殖和转移能力均减弱。最后,幽门螺杆菌阳性的胃癌组织及幽门螺杆菌感染后的人胃癌细胞ACS中的ASFlB表达水平均上调。结论ASFlB在幽门螺杆菌感染诱发的胃癌发生发展过程中可能起到重要的促进作用,且高表达的ASFlB与胃癌患者更早发生转移及较差的预后相关,可作为预测胃癌患者复发及预后的分子标志物。此外,敲低ASFIB可显著抑制ACS细胞的增殖和转移能力。【关键词】胃癌;抗沉默功能蛋白lB;幽门螺杆菌;细胞增殖;细胞转移Expre
5、ssion of anti-silencing functional protein 1B in human gastric cancer cells infected with Helicobacter pylori and its effect on proliferation and metastasis of AGS cell line Cai Yuzhi,伽Jian,Huang Yongye,Liu Dingyi,L加Haihua,Zhang Tong*Digestive Center,Guangzhou Panyu District Central Hospital,Guangzh
6、ou 511400,Guangdong,China*Corresponding author:Zhang Tong,E-m(1l,l: ObjectiveTo detect the expression level of histone chaperone anti-silencing functional protein lB(ASFlB)in gastric cancer(CC)tissues and its relationship with the prognosis of CC patients.To investigate the effects of ASFlB on the p
7、roliferation and metastasis ability of human CC cell line ACS and the possible molecular mechanism.To analyze the relationship between Helicobacter pylori and the expression of ASFlB.Method The expression level of ASFlB in various of tumor tissues and adjacent normal tissues in 基金项目:广州市科技计划项目(202102
8、080538)通信作者:张彤,E-mail:-i;仑著消化肿瘤杂志电子版2024年3月第16卷第1期J Dig Oncol(Electronic Version).March 2024.Vol 16.No.I the cancer genome atlas database was analyzed,and then the mRNA expression level of ASFlB in 59 pairs of GC tissues and paired adjacent normal tissues of our cohort were measured via real time fl
9、uorescent quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR).The relationship between the expression levels of A SFlB and the prognosis of GC patients in Kaplan-Meier plotter database was analyzed.Besides,the expression levels of ASFlB in GC tissue microarray were detected by immunohistochemistry,and t
10、hen the relationship between ASFlB and clinical prognosis and clinicopathological parameters of GC patients was analyzed.Small interfering RNA(siRNA)technology was used to knockdown the expression of ASFlB in GC cell line AGS,and AGS cells were divided into siNC group(negative control transfected ce
11、lls),siASFlB#l group,siASFlB#2 group and siASFlB#3 group.Then the proliferation and metastasis ability of different groups were detected by CCK-8,plate monoclonal assay and Transwell cell migration assay.The expression levels of ASFlB in GC tissues with positive and negative Hel比obacterpylori in gen
12、e expression omnibus database(GSE27411)were analyzed,and then the expression levels of ASFlB in GC cell line AGS before and after Hel兀obacterpylori infection were detected by RT-qPCR and western blot.Result The mRNA and protein expression levels of ASFlB in GC tissues of the database and our cohort
13、were higher than those in adjacent normal tissues.Moreover,higher expression of ASFlB in GC tissues was correlated with the poorer prognosis of GC patients.Compared with siNC group,the ability of cell proliferation and metastasis were reduced in the ASFlB knockdown group(siASFlB#l group,siASFlB#2 gr
14、oup and siASFlB#3 group).Finally,the expression levels of ASFlB in Hel比obacterpylori-positive GC tissues and Helicobacter pylori-infected human GC cells AGS were up-regulated.Conclusion ASFlB may play an important role in the occurrence and development of GC induced by Hel比obacterpylori infection.Be
15、sides,high expression of ASFlB is associated with earlier metastasis and poorer prognosis of GC patients,which can be used as a molecular marker to predict recurrence and prognosis of GC patients.In addition,knocking down ASFlB significantly inhibited the proliferation and metastasis ability of AGS
16、cell.Gastric cancer;Anti-silencing functional protein lB;Helicobacter pylori;Cell proliferation;Cell metastasis 59 胃癌(gastriccancer,GC)是全世界范围内发病率和死亡率最高的消化道恶性肿瘤。根据世界卫生组织发布的世界癌症报告显示,2020年我国新增胃癌病例47.9万,死亡人数37.4万,分别占全球胃癌新发和死亡病例的44和48.6%l一气胃癌起病隐匿,早期症状少,患者就诊时多巳是晚期,临床治疗也常因复发、转移而失败。因此,提高早期胃癌的检出率,改善胃癌患者临床治疗效
17、果,进而使得胃癌患者的生存时间延长,巳成为胃癌患者治疗的目标。而相关问题的解决不仅有赖千整体医疗体系的完善以及治疗手段的提高,更有赖千对胃癌发生及恶性进展机制的充分认知以及挖掘有效的干预靶点和用千早期诊断的相关检测指标3。抗沉默功能蛋白1(anti-silencing functional protein 1,ASFl)最早是科学家在真核生物酵母中发现的,其属千组蛋白相关蛋白的伴侣蛋白,具有调节染色质的功能,并已被证明与多种肿瘤的发生发展密切相关4气哺乳动物中有2种ASFl亚型,分别是组蛋白伴侣ASFlA和组蛋白伴侣ASFlB。ASFlB是一种重要的组蛋白伴侣蛋白,最早在芽殖酵母中被检测出来,
18、进一步研究显示其具有转录调节作用,并调控多种基因的表达,其主要功能是参与细胞增殖6-8。近年来,研究表明ASFIB与多种肿瘤的发生发展密切相关,例如,过表达ASFIB与乳腺癌预后密切相关,而ASFIB敲除后则会显著抑制乳腺癌细胞的增殖能力9。而Liu等10的研究发现ASFlB通过稳定周期依赖性激酶9(cyclin-dependent kinases 9,CDK9)蛋白表达来促进宫颈癌的恶性进展,初步揭示了ASFIB的促癌机制。此外,ASFIB在肝癌、前列腺癌及胰腺癌中的作用也逐渐被揭示11-13。然而,目前ASFIB在胃癌中的表达及预后价值仍不清楚。因此,本研究拟探讨ASFIB对人胃癌细胞增殖
19、与转移能力的影响及其可能的机制,并探讨ASFIB表达水平在人胃癌细胞系感染幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)后的变化情况,初步探讨ASFIB在Hp感染引起的胃癌中所发挥的作用,并探讨其与胃癌患者预后之间的关系,进而为其作为胃癌的早60 消化肿瘤杂志电子版2024年3月第16卷第1期J Dig Oncol(Electronic Version).March 2024.Vol 16.No.I 期诊断、预防以及治疗的分子靶标提供一定的理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本胃癌组织芯片样本来自本院2013年1月至2017年12月接受胃癌切除手术并经病理证实为胃癌的患
20、者94例,其中男51例,女43例,年龄3579岁,平均年龄(61.3土5.6)岁。用千实时荧光定量聚合酶链反应(realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)的新鲜胃癌组织及配对的癌旁正常组织取自本院2020年1月至2021年12月行根洽性胃癌切除术的胃癌患者59例,样本共59对,以距离胃癌组织25cm以外的为癌旁正常组织。所有患者均取得书面知情同意,并通过广州市番禺区中心医院伦理委员会批准(审批号:PYRC-2023-331)。AGS人胃癌细胞系购买自上海细胞基囚库。1.1.2 试剂及耗材DMEM-F1
21、2培养基、胎牛血清(fetalbovine serum,FBS)及1的双抗(青链霉素混合液)购自美国Gibco公司;SYBRGreen I试剂购自中国长沙AG公司;RNATRlzol、结晶紫购自日本TaKaRa公司;辣根过氧化物酶购自美国Millipore公司;小鼠抗人GAPDH单克隆抗体、兔抗人ASFIB单克隆抗体购自中国Abeam公司;ECL蛋白印迹底物购自美国Thermo公司;CCK-8购自中国Boster公司。1.2 方法1.2.1 生物信息学分析使用分析工具TIMER2.0(http:/timer.cistrome.org/)分析癌症基因组图谱(thecancer genome at
22、las,TCGA)数据库中的ASFIB在泛瘤种的肿瘤组织和癌旁正常组织中的表达悄况。使用分析工具GEPIA2(http:/gepia2.cancer- plotter 数据库(http:/ omnibus,GEO)数据库中的GSE27411数据集进行分析来探讨Hp阳性和Hp阴性的胃癌组织中ASFIB的表达水平。1.2.2 细胞培养AGS细胞在含有10%FBS、1青链霉素混合液的DMEM-F12培养基中培养,并置千37C、5%CO2培养箱中,常规进行换液。1.2.3 细胞转染培养AGS细胞至对数生长期,使用0.25的胰酶消化细胞,按照一定的比例转移至6孔板中,待细胞达到一定的密度后,进行转染,具
23、体步骤参照Lipofectamine3000转染试剂说明书,分别转染阴性对照和敲低ASFIB的小干扰RNA(smallinterfering RNA,siRNA),阴性对照转染细胞标记为siNC组,敲低ASFlB3条不同序列的转染细胞分别标记为siASFlB#l组、siASFlB#2组及siASFlB#3组。1.2.4 RT-qPCR RNA提取试剂盒(Magen,中国)被用千从胃癌组织、正常胃黏膜组织及细胞中提取总RNA,并使用Nanodrop测最RNA浓度。此后,使用反转录酶(艾科瑞生物公司,中国)将所得到的RNA反转录为cDNA,反应条件为首先37C 15 min,接着85 C 5 s,
24、最后4C 30 min。之后,使用荧光DNA结合染料(艾科瑞生物公司,中国)进行qPCR反应,具体步骤按照说明书进行。引物来自中国天一辉远公司。GADPH作为内参基因,引物序列为:正义链5-TGCCTTGGCTTAGAGAC-3;反义链5-CTGCTATTCCGAATTC-3。用千检测ASFIB表达量的引物序列为:正义链5-ACACTGGAGTG AAGAT-3;反义链5-GCTGGAGCTGGGAGAAAT-3。后续根据相应的反转录及qPCR试剂盒的说明书进行实验。计算2-MCt值为ASFIB的相对表达最。1.2.5 蛋白质印迹法蛋白裂解液被用于从胃癌组织和胃癌细胞中提取其蛋白质组分,其中蛋
25、白裂解液按照1ml裂解缓冲液10l磷酸酶抑制剂10 l苯甲基磺酰氮(100mmol/L)+1 l蛋白酶抑制剂的比例配置。而后对所得到的待测蛋白样品进行BCA定最浓度测定后,按照实验设计向每个泳道对应加入20g 蛋白进行电泳,再转移至聚偏二氝乙烯膜上,进一步使用5牛血清白蛋白室温封闭2h,一抗4C 消化肿瘤杂志电子版2024年3月第16卷第1期J Dig Oncol(Electronic Version).March 2024.Vol 16.No.I 61 孵育过夜。使用TBST洗涤蛋白膜3次,每次lOmin,然后使用相对应的lgG二抗室温孵育1h,再用TEST洗涤蛋白膜3次后,使用相应的曝光显
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