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评价快速碳青霉烯酶灭活试验在肠杆菌科细菌碳青霉烯酶表型检测中的应用价值.pdf
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1、32024,14(2)医师在线 第 14 卷 第 2 期论著评价快速碳青霉烯酶灭活试验在肠杆菌科细菌碳青霉烯酶表型检测中的应用价值孙文悦,周小梅,卢金英,梁栋伟(广东省人民医院南海医院检验科,广东佛山 528200)【摘要】目的 评价快速碳青霉烯酶灭活试验(rCIM)与改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)在肠杆菌科细菌碳青霉烯酶表型检测中的应用价值。方法 选择 86 株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌,使用聚合酶链式反应(PCR)检测常见碳青霉烯酶基因,比较 rCIM 与 mCIM 法检测碳青霉烯酶表型的性能。结果 共检测到 61 株碳青霉烯酶基因型,检出率为 70.9%。mCIM 法发现阳性菌株 61 株
2、,阴性菌株 25 株,rCIM 法发现阳性菌株 62 株,阴性菌株 24 株。以 PCR 结果作为金标准,mCIM 法的准确度、灵敏度和特异度分别为 100.0%、100.0%和 100.0%,rCIM 法的准确度、灵敏度和特异度分别为 98.8%、100.0%和 96.0%。结论 rCIM 法检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶表型,操作简便,不需过夜培养,不需特殊的仪器或试剂,准确度较高。【关键词】肠杆菌科;碳青霉烯酶;碳青霉烯酶灭活试验Evaluation of the value of a rapid carbapenemase inactivation method for the pheno
3、typic detection of carbapenemases in EnterobacteriaceaeSUN Wen-yue,ZHOU Xiao-mei,LU Jin-ying,et al.Department of Laboratory Medicine,Nanhai Hospital,Guangdong Provincial Peoples Hospital,Foshan 528200,China.【Abstract】Objective To evaluate the application value of rapid carbapenemase inactivation met
4、hod(rCIM)and modified carbapenem inactivation method(mCIM)in the phenotypic detection of carbapenemases in Enterobacteriaceae.Methods 86 strains of carbapenem resistant Enterobacteriaceae were selected.The common carbapenemase genes were detected by Polymerase chain reaction(PCR).The performance of
5、rCIM and mCIM in detecting carbapenemase phenotype was compared.Results A total of 61 carbapenemase genotypes were detected,with a detection rate of 70.9%.The mCIM test found 61 positive strains and 25 negative strains,while the rCIM test found 62 positive strains and 24 negative strains.With PCR re
6、sults as the gold standard,the coincidence rate,sensitivity and specificity of mCIM test were 100.0%,100.0%and 100.0%,respectively,and those of rCIM test were 98.8%,100.0%and 96.0%,respectively.Conclusion The rCIM assay detects the carbapenemase phenotype of Enterobacteriaceae bacteria,which is easy
7、 to operate,doesnt require overnight culture,doesnt require special instruments or reagents,and has high accuracy.【Key words】Enterobacteriaceae;Carbapenemase;Carbapenemase inactivation method碳青霉烯类抗生素是治疗多重耐药革兰阴性菌的首选药物,据国内监测数据显示,肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药率可达 10.0%27.6%1,产生碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药的最主要机制,由于碳青霉烯酶基因大多位于可
8、移动基因元件上,导致其很容易在不同肠杆菌科细菌间转移,在短时间可导致大范围的流行播散,碳青霉烯酶表型检测有助于指导临床用药2。改良碳青霉烯灭活试验(Modified carbapenem inactivation method,mCIM)对碳青霉烯酶表型检测具有较高的灵敏度和特异度3。本研究拟评价快速碳青霉烯酶灭活试验(Rapid carbapenemase inactivation method,rCIM)在肠杆菌科细菌碳青霉烯酶表型检测中的应用价值,以期为临床提供实验数据。1 材料与方法1.1 菌株来源收集 2016 年 1 月 2023 年 5 月我院临床分离的耐碳青霉烯肠杆菌科细菌(亚
9、胺培南或美罗培南任一耐药)86 株,包括肺炎克雷伯菌 37 株,产酸克雷伯菌 5 株,大肠埃希菌23 株,阴沟肠杆菌 15 株,产气肠杆菌 4 株,弗氏枸橼酸杆菌 2 株。菌株鉴定及药敏采用 Phoenix100 全自动细菌鉴定/药敏仪,质控菌株大肠埃希菌 ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、肺炎克雷伯菌 ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌 ATCC BAA-1706 均购自国家卫生健康委临床检验中心。1.2 主要仪器与试剂Phoenix100 全自动细菌鉴定/药敏仪购自美国 BD 公司;聚合酶链式反应(PCR)扩增仪购自美国 ABI 公司;血琼脂平板、麦康凯平板和 M
10、ueller-Hinton 琼脂(MHA)平板购自广州市迪景微生物科技有限公司;胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基购自杭州滨和微生物试剂有限公司;亚胺培南、美罗培南药敏纸片购自英国 OXOID 公司。基金项目:佛山市卫生健康局医学科研课题(20230231)2024医师在线杂志 第2期-输出稿.indd 32024医师在线杂志 第2期-输出稿.indd 32024/2/20 10:25:322024/2/20 10:25:3242024,14(2)医师在线 第 14 卷 第 2 期论著1.3 菌株复苏 将-80保存的菌株在室温下复苏后接种于麦康凯平板上,35孵育 16 24 h,挑取单个菌落接种
11、于血琼脂平板上,35孵育 16 24 h 获得纯培养菌落。1.4 mCIM参考美国临床和实验室标准协会抗微生物药物敏感性试验执行标准 2017 版,用 1 l 接种环满环刮取在血琼脂平板上的过夜培养纯菌落(肠杆菌科细菌),接种于2 ml TSB培养基中,涡旋震荡混匀1015 s,每管放入1张含10 g美罗培南纸片,确认纸片浸没于菌悬液中,35培养箱孵育 4 h。孵育结束时,用生理盐水制备0.5麦氏浊度的大肠埃希菌ATCC25922悬液,用 10 l 接种环将美罗培南纸片从 TSB 培养基中取出,将纸片贴于试管内壁,轻轻按压以挤去纸片上多余水分,然后将纸片取出贴于已涂布有大肠埃希菌 ATCC25
12、922 的 MHA 平板上。100 mm 的 MHA 贴 4 张纸片,倒置平板,35培养箱孵育18 24 h,量取抑菌圈直径。结果判读:抑菌圈直径 6 15 mm,或直径 16 18 mm 但其内有散在菌落生长,为碳青霉烯酶阳性菌株;抑菌圈直径19 mm,为碳青霉烯酶阴性菌株;抑菌圈直径 16 18 mm,则无法判断是否存在碳青霉烯酶。1.5 rCIM参考文献4,先制备 3 mm MHA(Thin Mueller Hinton Agar,tMHA)平板备用。生理盐水制备 3.0 麦氏浊度的大 肠 埃 希 菌 ATCC25922 悬 液,均 匀 涂 布 于 100 mm 的tMHA 平板,干燥
13、3 10 min 备用。用 10 g 亚胺培南纸片一面刮取在血琼脂平板上的过夜培养纯菌落 1 3 个,将含有待测细菌的亚胺培南纸片一面放入已涂布大肠埃希菌ATCC25922 的 tMHA 平板上,35培养箱孵育 5 h,同时用不沾待测菌亚胺培南纸片作为对照组。结果判读:与对照组相比,待测菌抑菌圈直径降低 5 mm,为碳青霉烯酶阳性菌株;待测菌抑菌圈直径降低 3 5 mm,无法判断是否存在碳青霉烯酶;待测菌抑菌圈直径降低 3 mm,为碳青霉烯酶阴性菌株。1.6 碳青霉烯酶基因检测对 KPC、NDM、IMP、VIM、OXA-48 五种常见碳青霉烯酶基因型进行分析。PCR 反应体系(20 l):pr
14、emix Taq 酶10 l,上下游引物各 0.4 l(浓度 10 mol/L),DNA 模板2 l,ddH2O 7.2 l。扩增条件:预变性,94 30 s;循坏,94 30 s,55 30 s,72 1 min,共 35 个循环;延伸,72 10 min。扩增完毕,PCR 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,选取阳性产物送测序。1.7 统计学分析采用 SPSS 18.0 统计软件进行数据分析。以 PCR 结果为金标准,计算 mCIM 和 rCIM 的准确度、灵敏度和特异度。计算公式:准确度=(真阳性+真阴性)例数/总例数100%;灵敏度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)100%;特异度=
15、真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)100%。率的比较采用2检验,P 0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 碳青霉烯酶基因型及表型检测结果86 株碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌共检测出 61 株碳青霉烯酶基因型,检出率为 70.9%(61/86),以 KPC 和 NDM 酶(包括两者混合阳性者)为主,其中 KPC 酶 29 株,NDM 酶 27株。mCIM 法发现阳性菌株 61 株,阴性菌株 25 株,检出率为70.9%(61/86);rCIM法发现阳性菌株62株,阴性菌株24株,检出率为 72.1%(62/86);两种方法的检出率比较,差异无统计学意义(P 0.05),详见表 1。2.2
16、 rCIM 与 mCIM 法检测性能比较以 PCR 结果作为金标准,mCIM 法的准确度、灵敏度和表 1 碳青霉烯酶基因型和表型检测阳性分布(株)细菌类别(n=86)基因型(n=61)mCIM(n=61)rCIM(n=62)肺炎克雷伯菌(n=37)KPC(15)1515NDM(5)55IMP(3)33KPC+NDM(2)22阴性(12)01产酸克雷伯菌(n=5)KPC(2)22IMP(1)11KPC+IMP(1)11阴性(1)00大肠埃希菌(n=23)NDM(10)1010KPC(2)22VIM(2)22KPC+NDM(1)11阴性(8)00阴沟肠杆菌(n=15)IMP(2)22NDM(3)3
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