基于TMT蛋白质组学研究黄芪甲苷干预脓毒症肺损伤作用靶点的研究.pdf

2024年第4 5卷第2 期实验研究基于TMT蛋白质组学研究黄芪甲苷干预脓毒症肺损伤作用靶点的研究张春菲，张浩洪，李晓红”，吴招，邹楠婷，杨海浩，巨鸣谦，莫庆艳，万春平1.2（1.云南中医药大学，云南昆明6 50 50 0；2.楚雄州中医医院，云南楚雄6 7 50 0 0）摘要：目的采用TMT蛋白质组学研究黄芪甲苷对脓毒症小鼠肺组织蛋白组学的影响，为其临床应用治疗脓毒症提供科学依据。方法采用盲肠结扎穿刺术(Cecal Ligation-Peferation,CLP）复制脓毒症小鼠模型，随机分为假手术组、模型组、黄芪甲苷组。H&E染色检测肺组织病理损伤；流式细胞术检测B细胞表达；提取肺组织蛋白，运用TMT蛋白质组学技术比较组间差异蛋白的表达，并进行生物信息学分析。结果与假手术组比较,模型组肺组织炎症细胞浸润严重，结构塌陷；黄芪甲苷干预显著减轻脓毒症模型小鼠肺组织病理损伤。与模型组比较，黄芪甲苷药物干预组小鼠脾淋巴细胞B细胞（B220+）表达无明显影响（P0.05）。T M T 蛋白质组学结果分析肺组织蛋白差异成分，结果共鉴定出33个显著性差异蛋白，黄芪甲苷干预上调17 个蛋白，下调16 个蛋白。CO富集分析显示，黄芪甲苷主要干预生物功能过程,其中与脓毒症肺损伤密切相关差异主要蛋白是介导黏膜免疫的IgA产生通路。结论黄芪甲苷对脓毒症诱导的肺损伤具有显著作用，其效应机制主要与干预B细胞分泌的IgA介导的黏膜免疫有关,该研究为黄芪临床治疗脓毒症奠定了基础。关键词：蛋白质组学；脓毒症；黄芪甲苷；免疫球蛋白A中图分类号：R256.1云南中医中药杂志文献标志码：A83文章编号：10 0 7-2 34 9(2 0 2 4)0 2-0 0 8 3-0 7Study on the Target of Astragaloside in the Intervention of Lung Injurywith Sepsis Based on TMT ProteomicsZHANG Chun-fei,ZHANG Hao-hong,LI Xiao-hong,WU Zhao,ZOU Nan-ting,YANG Hai-hao,JU Ming-qian,MO Qing-yan,WAN Chun-ping*-(1.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China;2.Chuxiong Hospital of Traditional Chinese Medicine,Chuxiong 675000,China)AbstractObjective:To study the effect of Astragaloside on lung tissue proteomics of sepsis mice by TMT pro-teomics and to provide scientific basis for its clinical application in the treatment of sepsis.Methods:The septic mousemodels were replicated by Cecal Ligation-Peferation(CLP),and the mice were randomly divided into sham operationgroup,model group and Astragaloside group.H&E staining was used to detect the pathological injury of lung tissue.The expression of B cells was detected by flow cytometry.Lung tissue proteins were extracted,the expression of differ-ent proteins was compared by TMT proteomic technique,and bioinformatics analysis was performed.Results:Com-pared with the sham operation group,the model group had severe inflammatory cell infiltration and structural collapse.Astragaloside intervention significantly alleviated the pathological injury of lung tissue in sepsis model mice.Comparedwith that of the model group,the expression of splenic lymphocyte B cells(B220+)in the Astragaloside interventiongroup had no significant effect(P0.05).The results of TMT proteomic analysis showed that 33 different proteins*基金项目：国家自然科学基金项目（8 196 0 7 4 5）第一作者简介：张春菲（1999）,女，在读硕士研究生，研究方向：中药抗炎免疫药理学研究。通信作者：万春平，E-mail:84were identified,among which 17 proteins were up-regulated and 16 proteins were down-regulated by Astragaloside.GO enrichment analysis showed that Astragaloside mainly interfered with biological functional processes,and the mainprotein closely related to lung injury in sepsis was IgA production pathway mediating mucosal immunity.Conclusion:Astragaloside has a significant effect on lung injury induced by sepsis,and its mechanism is mainly related to the inter-vention of IGA-mediated mucosal immunity secreted by B cells.This study lays a foundation for the clinical treatmentof Astragaloside in sepsis.Key words Proteomics;Sepsis;Astragaloside;Immunoglobulin A云南中医中药杂志2024年第4 5卷第2 期脓毒症是一种因感染导致的全身性炎症反应,是严重烧伤、创伤、感染以及外科手术常见的并发症。随着病情的发展,继而引发脓毒性休克,多器官功能障碍综合征及死亡，其中脓毒症合并急性肺损伤（a c u t e l u n g i n j u r y，A LI）是脓毒症主要并发症以及死亡的主要原因,其中目前尚无有效的治疗措施。黄芪作为治疗所有“气衰血虚”之病的常用补益中药已使用几千年,具有健脾补中,升阳举陷,益卫固表,利尿，托毒生肌等作用。在临床应用中,黄芪在抗肿瘤免疫疗法和抗感染免疫疗法中应用广泛。最新研究已报道,黄芪甲苷具有显著抗脓毒症的效应，但黄芪甲苷干预脓毒症合并急性肺损伤的作用靶点尚未明确，值得进一步研究。iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组研究,是对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内所有蛋白质进行标记,利用标记试剂中的二级报告离子来对蛋白进行精确鉴定和定量,是研究药物干预靶点一种重要手段。本研究拟通过TMT定量蛋白质组学探究黄芪甲苷对脓毒症肺损伤的效应机制,从而为其临床治疗脓毒症提供一定的科学依据。1材料和方法1.1实验动物勿C57BL/6小鼠,购自斯贝福（北京)生物技术有限公司,7 8 周龄,体重(2 0 2)g,雄性，合格证号：SCXK（京）2 0 19-0 0 10。动物饲养于SPF级动物房，适应性饲养1周。饲养条件：温度（2 2 1),湿度（555)%。饲料与水均经过消毒处理，并由动物自由摄取。全部动物实验均严格按照实验动物有关条例实施。实验方案通过云南中医药大学第一附属医院动物伦理委员会审查（DW2023-003）。1.2药物与试剂黄芪甲苷（批号：110 7 8 3201713)购自大连美仑生物iTRAQ试剂盒购自AB-SCIEX;1640培养基（批号：4 12 6 0 0 30 0）购自北京Solarbio公司；青霉素（批号：H3702081）购自山东鲁抗医药股份有限公司；TMTMassTaggingKitsandRea-gents 购自Thermo;Bradford蛋白定量试剂盒购自碧云天;二硫苏糖醇 DTT购自 Sigma;碘代乙酰胺IAM,购自Sigma；十二烷基硫酸钠SDS,购自国药;尿素购自国药；质谱级胰酶购自Promega/V5280;碳酸氢铵购自Sigma/5330050050;LC-MS级超纯水购自ThermoFisherChemical/W6-4；三乙基碳酸氢铵缓冲液TE-AB,购自Sigma/T7408-500ML;LC-MS级乙腈购自Thermo Fisher Chemical/A955-4;LC-MS 级甲酸购自 Thermo Fisher Scientific/A117-50;丙酮购自北京化工厂/112 4 12 0 38 10 0 51;氨水购自Sigma/221228-500ML-A;ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒购自Bio-Rad/1633007;三氟乙酸TFA,购自 Sigma/6508-100ML。1.3主要仪器EASY-nLCTM1200纳升级UHPLC（购自ThermoFisher/LC140）；质谱仪：QExactiveTMHF-X质谱仪（购自Thermo）、O r b i t r a p Ex p l o r i s 4 8 0 质谱仪（购自Thermo）;分馏色谱L-3000HPLC、低温离心机（购自Scilogex/D3024R）；冷冻干燥机（购自Labo-gene/ScanSpeed40);电泳仪（购自Bio-Rad);电泳槽（购自BioR a d）；电子天平（购自Sartorius/BSA124S)；涡旋混合器（购自光合/HY-6B）；酶标仪（购自Thermo/MultiskanFC）；制冰机（购自雪科）;组织研磨仪（购自上海净信/2 4 孔）；超声波细胞破碎仪（购自宁波新芝/JY92-11N）。2方法2.1脓毒症模型的构建C57BL/6小鼠适应性饲养2024年第4 5卷第2 期5d后,术前禁食,不禁水。采用国际公认的盲肠结扎穿孔术对小鼠进行脓毒症造模 2 。具体方法如下：小鼠用4%的水合氯醛腹腔注射麻醉,注射体积为10mL/kg麻醉。麻醉后背位固定小鼠,备皮处理,沿腹中线做1cm切口,开腹分离肠系膜及盲肠，用4 号线在盲肠近端1/3处结扎,2 1g号针在结扎部位中部处贯通穿刺,在穿孔处挤出少量粪便，随后将盲肠回纳人腹腔，逐层缝合关腹。术后每只小鼠肌注青霉素210*U以预防切口感染的同时,立即皮下注射37 生理盐水5mL/100g（补充术中液体丢失）和0.05mg/kg丁基原啡因（每6 h1次,持续2 d），作为对照假手术组找出盲肠后不穿刺迅速将盲肠回纳入腹腔,其余同上述操作。2.2分组和给药术后2 h,30只小鼠随机分为3组：假手术组、模型组、黄芪甲苷组。黄芪甲苷组灌胃黄芪甲苷10 mg/kg。假手术组和脓毒症模型组灌服等体积生理盐水;将小鼠饲养于SPF级动物实验室,随时观测小鼠状态和体征,给药2 4 h后处理取材。2.3H&E染色检测肺组织病理损伤取右肺叶上叶组织约0.5cm0.3cm1 cm大小的,浸于4%多聚甲醛中12 h,梯度乙醇进行组织脱水,液态石蜡包埋,4 m切片，载玻片捞片后烘烤2 h。再用二甲苯、乙醇处理脱蜡，苏木素浸染，1%盐酸乙醇分化,伊红浸染,再次进行梯度乙醇脱水,二甲苯透明,最后采用中性树胶封片，显微镜下观察肺组织病理学变化。2.4流式细胞术检测脾脏B细胞表达水平取小鼠脾脏，载玻片研磨脾脏，滤膜过滤，4 12 0 0 rpm离心5min，弃掉上清，红细胞裂解液裂解红细胞，加入2%FBS的16 4 0 培养基终止裂解。PBS洗两次后，加入10%FBS1640培养基。配密度为2 10 6个/mL的细胞，加人荧光标记的B220抗体，4 孵育15min，洗液洗1次，流式细胞仪进行检测,Flowjo软件分析结果。2.5总蛋白提取与蛋白定量精密称取适量肺组织样品，在装有液氮的研钵中将样本研磨至粉末。加入适量的 SDT(含10 0 mMNacl)和DTT溶解,振荡混匀，冰水浴超声5min使其充分裂解。9 5反应8 15min,冰浴2 min，于4、12 0 0 0 g离心15min,取上清云南中医中药杂志加人足量IAM溶液，放置在黑暗条件下反应1h。在-2 0 条件下加入4 倍量经-2 0 预冷的丙酮沉淀，沉淀时间2 h以上，4、12 0 0 0 g离心15min，收集沉淀。之后加人1mL-20预冷丙酮重悬并清洗沉淀，收集沉淀，风干，沉淀即总蛋白。加人适量Dis-solved Buffer（D Bb u f f e r），彻底溶解蛋白沉淀。采用Bradfold蛋白定量试剂盒对蛋白定量。2.6蛋白酶解脱盐将蛋白样品取出,加人DB蛋白溶解液补足体积到10 0 L,加人胰酶和10 0 mMTE-AB缓冲液，搅拌均匀后在37 C条件下酶切4 h,再加人胰酶和CaCI2 酶切过夜。加人甲酸调节 pH小于3,搅拌均匀后于室温、12 0 0 0 g离心5min，取上清缓慢通过C18除盐柱，之后使用清洗液连续清洗3次，再加人适量洗脱液，收集滤液，冻干。2.7TMT肽段标记与分级加入10 0 L0.1MTEAB缓冲液复溶,并加人4 1L乙溶解的TMT标记试剂，常温下颠倒混匀2 h。之后终止反应加人终浓度8%氨水,取等体积标记后的样品混合,除盐后冻干。之后制备流动相A液（2%乙腈、98%水、氨水调节PH到10)和B液(98%乙腈、2%水）。将冻干粉溶解在A液中，414 0 0 0 g 离心2 0 min。使用L-3000HPLC 系统,柱温设为4 5当时间为0 min时，流速为1mL/min,97%的流动向A,3%的流动相B;10min时,流速为1mL/min,95%的流动向A,5%的流动相B;30min时，流速为1mL/min,80%的流动向A,20%的流动相B;48min时，流速为1mL/min,60%的流动向A,40%的流动相B；50min时，流速为1mL/min,50%的流动向A,50%的流动相B;53min时，流速为1mL/min,30%的流动向A，70%的流动相B;54min时，流速为1mL/min,0%的流动向A,100%的流动相B。每分钟收集1管，合并为10个馏分冻干,加人0.1%甲酸。2.8液质检测及数据分析馏分上清使用EASY-nLCTM1200纳升级UHPLC系统,预柱（4.5cm75m,3m）,分析柱(2 5cm150m,1.9m）,55柱温箱,流动相A液（10 0%水、0.1%甲酸）和B液（8 0%乙腈、0.1%甲酸）进行梯度洗脱。使用OrbitrapExploris480(加FAIMS)质谱仪,Nanospray FlexTM(ESI)离子源,数据依赖型采集模式采集参数，生成质谱检测原始数据。8586搜素库软件ProteomeDiscoverer2.4（PD 2.4,T h e r m o）分别搜索每个run 的结果谱图,保留可信的谱肽和蛋白,并做 FDR验证。T-test 检验对蛋白质定量结果进行统计分析,标记实验组和对照组之间定量差异显著的差异表达蛋白(DEP）。利用 InterProScan软件进行 GO功能注释、Perl module软件进行富集分析、R Packagepheatmap软件进行聚类热图分析。2.9统计学方法采用SPSS22.0和GraphPadPrism9.5.1软件对数据进行分析，全部计量数据均以平均值标准差表示,2 组间均数差异性比较采用t云南中医中药杂志检验,多组间均数差异性比较采用单因素方差分析。P0.05），提示黄芪甲苷干预并不影响B淋巴细胞表达，可能主要影响B细胞功能,如图2。H1.0K-800-29.129.11010250740-30.580030.54002001030-2010-010102P0.05的标准进行显著性差异表达蛋白质的筛选。其中33个蛋白质的表达具有显著性差异，黄芪甲苷干预显著上调17 个蛋白,显著下调16 个蛋白。结果见图3。差异蛋白表达聚类热图见图4。1031oMH2024年第4 5卷第2 期云南中医中药杂志M.vs.H387downNoneup20-4-2Log2FoldChangeM.vs.H图3黄芪甲苷（H)组与模型（M)组差异蛋白火山图M.VS.H2Q8R4E6035075G3UZEgQ8BKX6035659Q544J2Q8BMY1055042O7TMG7Q62159Q9CQ39P60824Q8OUN9Q3UR49A0A3Q4EH78P97492Q3TIVSP32848AOAOG2JGN3Q4VAC9Q99JC1Q9CPS6ADA494BAV5A0A338P776Q8K2X8S4R2L3Q3UDB1A0A1Y7VMD8Q6P3A9070570Q91VWOQ3UM18AOAOH2UKCOM3M1M图4黄差异蛋白表达的聚类热图-2M2H3H1HH2883.4差异蛋白GO富集分析为揭示鉴定到的差异蛋白的功能、特征等,我们从GO方面进系统的解析。GO可以分为分子功能Molecular Function（M F）,生物功能Biological Process(BP)和细胞组成 Cellular Component(CC)三个部分。差异蛋白GO功能富集结果显示,在模型组(M)组和黄芪甲苷(H)组中差异蛋白与全部蛋白在BP、CC、M F三个部分的富集趋势并不一致，差异蛋白主要分布在 BP过程中。BP中与脓毒症密切相关的机制有细胞对刺激的反应(cellular response to stimu-lus）、核苷酸的切除修复（nucleotide一excision repair）、云南中医中药杂志2024年第4 5卷第2 期EnrichedGOTerms(M.vs.H)8xeidwdsuen532ATP合成偶联质子传递（ATP synthesis coupled protontransport)。在CC类中主要集中在核心TFIIH复合物（c o r e T FIIH c o m p l e x）。在MF中主要聚焦在三磷酸鸟苷结合(GTPbinding),结果见图5。3.5差异蛋白KEGG富集分析对2 组差异蛋白分别进行KEGG富集分析，发现差异蛋白主要富集于用于IgA生产通路、不饱和脂肪酸的生物合成、帕金森病等通路(见图6)。M.vs.HIntestinal immunenetworkforIgAproductionBiosynthesis ofunsaturatedfattyacidsNeuroactive ligand-receptor interactionBasal transcriptionfactorsInsulin secretionNucleotideexcision repairFattyacidmetabolismArrhythmogenic rightventricularcardiomyopathy(ARVC)PPAR signaling pathwayViralmyocarditisHypertrophiccardiomyopathy(HCM)Ribosomebiogenesis ineukaryotesDilatedcardiomyopathy(DCM)ParkinsonsdiseaseAdherens junctionSalmonella infectionRap1signaling pathwayHippo signaling pathwayAlzheimersdisease-mRNAsurveillance pathway图6黄芪甲苷（H)组与模型（M)组差异蛋白KEGG通路富集气泡图4/eubisBPCCMF图5黄芪甲苷(H)组与模型(M)组差异蛋白GO分析0.0250.050RatioNumber1.001.251.501.752.00-log10(Pvalue)1.31.10.90.0752024年第45卷第2 期4讨论最新研究结果表明，黄芪皂苷不仅具有显著的免疫增强活性，而且还有优良的抗炎作用 3 ,能够显著抑制细菌脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞炎症因子(TNF-、I L-6、I L-1和NO)产生，下调转录因子NF-kB激活和AP-1DNA结合活性 4。在抗感染方面,黄芪甲苷对柯萨奇B3病毒有明显的抑制作用,临床用于病毒性心肌炎的治疗，其作用机制与诱导Th1细胞因子IFN转录及分泌相关 5。上述研究表明黄芪皂苷在抗炎，免疫增强以及抗感染等方面有明显药理作用，同时这些药理作用对改善脓毒症患者体内免疫抑制状态以及清除病原体等方面也有重要治疗作用，然而黄芪皂苷抗脓毒症确切的作用机制尚未明确，仍缺乏有效作用靶标的深入研究，这一定程度阻碍传统黄芪临床应用于治疗脓毒症。TMT是一种基于肽段层面的体外标记技术,其原理是标志物特异性标记多肽的氨基端，然后再进行质谱分析。因此,本研究采用此方法筛选黄芪甲苷干预脓毒症作用靶点,结果共鉴定出3 3 个显著性差异蛋白,黄芪甲苷干预上调17 个蛋白，下调16 个蛋白。GO富集分析显示,黄芪甲苷主要干预生物功能过程，其中与脓毒症肺损伤密切相关差异蛋白主要是介导黏膜免疫的IgA产生相关通路。研究表明,脓毒症患者体内有不同程度免疫功能紊乱的情况。IgA在血清总的免疫球蛋白内占比约15%,具有较强的抑制毒素、抑制病毒及抑菌的效果 6 。而B细胞在抗原的刺激下可以分化为浆细胞，浆细胞合成分泌免疫球蛋白抗体，包括IgA。流式结果显示,黄芪甲苷干预并不影响B淋巴细胞表达。最新研究表明，与假手术组比较，脓毒症病理模型小鼠血清中IgA的水平明显升高,提示IgA水平与脓毒症发生与转归密切相关 7 。IgA由plgA协助从面膜上云南中医中药杂志皮的基底膜侧运送到根尖侧，分泌进入黏膜外粘液中,plgR在IgA分泌到胞外发挥抵抗病原微生物的过程中发挥重要作用。综上所述结果,推测黄芪甲苷可能通过影响B细胞的功能,调控IgA生产,从而改善脓毒症诱导肺损伤,确切作用机制需要进一步实验验证，该研究为黄芪临床应用脓毒症治疗、传承与创新奠定理论基础。参考文献：1 Qi Y,Gao F,Hou L,et al.Anti-Inflammatory and Immunos-timulatory Activities of Astragalosides J.The American 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