氟苯尼考的高效液相色谱检验方法.doc
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1、武汉轻工大学毕业论文 论 文 题 目:鸡血浆中氟苯尼考高效液相色谱检测办法 Development of a HPLC for determination of florfenicol in chicken plasma 姓 名: 吕阳 学 号: 院 (系) 动物科学与营养工程学院 专 业 动物生物技术 指引教师 刘宇 6月1日目 录摘 要1Abstract2第一章 绪 论31氟苯尼考研究进展31.1氟苯尼考药物信息31.2氟苯尼考临床应用41.3氟苯尼考检测办法52研究目与意义63研究内容6第二章 实验研究71 材料与办法71.1实验材料71.2实验动物71.3实验办法72 成果与计算82.
2、1波长选用82.1工作曲线102.2回收率与精密度102.4 HPLC检测图谱113讨论13第三章 结论与建议141 结论142创新点143有待进一步研究问题14参照文献15致 谢16摘 要 本文建立了鸡血浆中氟苯尼考含量高效液相色谱检测办法,办法线性范畴为1.0200 g/ml,线性方程为y = 50x + 170000(r =0.9994),回收率达到86.3%98.5%,办法定量限最低为0.1 g/ml,日内与日间相对原则偏差均不大于5%。本法色谱柱使用Waters 04590型Symmetry-C18柱(4.6150 mm,5m),柱温为30,流动相使用乙腈:水=27:73(V:V),
3、进样量10 L,流速1.0 ml/min,紫外检测波长为230nm。经验证,本办法具备简便快捷、定量精确,线性关系良好,回收率较高等长处,可觉得氟苯尼考药物代谢动力学研究提供定量根据和检测基本。核心词: 氟苯尼考,高效液相色谱,鸡AbstractThis paper established the chicken florfenicol in plasma of high performance liquid chromatography (HPLC) method,the linear relationship between the absorbance and concentration
4、 of tilmicosin was in the range of 1.0 to 200g/ml with a minimum detection limit of 0.1g/ml (r = 0.9997),the linear equation:y = 12674x + 16319,the recoveries ranged from 86.3% to 98.5%,the values of intra-day relative standard divination and inter-day relative standard divination were less than 5%.
5、Waters 04590 Type Symmetry-C18 column (4.6 150 mm,5m) was used in the analysis,a mixture of acetonitrile-water,at a flow rate of 1.0 ml/min was used as mobile phase,passing through the column at 30 . Ultraviolet detection was performed at the wavelength of 230nm. Key words:High Performance Liquid Ch
6、romatography,Florfenicol,Chicken 绪 论1 氟苯尼考研究进展1.1 氟苯尼考药物信息 氟苯尼考(florfenicol)1又称作为氟甲砜霉素,由于其拥有广泛抗菌谱,在体内极易吸取,分布较为广泛,治疗剂量下未发现毒副作用,防治效果明显,对于敏感菌所引起动物细菌性疾病具备极佳治疗效果,广泛应用于养殖业中,是兽用药物中当前正在广泛推广使用一种新型氯霉素类广谱抗菌药。现如今,氟苯尼考已经在水生动物、禽类、猪、反刍动物以及其她畜禽细菌性疾病2防止和治疗中广泛使用,当前国内已经通过了该药审批。1.1.1 性状与构造 纯净氟苯尼考性状为结晶性粉末,白色或类白色,无臭。在普通状
7、况下,在有机溶剂中溶解度较高,溶解在水中剂型大多为混悬液。氟苯尼考在二甲基甲酰胺中溶解度极高,溶解于甲醇,溶剂为冰醋酸时略微溶解,水或氯仿时中溶解度极低3。浓度为0.5%氟苯尼考水溶液酸碱度大概在4.56.5范畴内4。市场上出售氟苯尼考商品名称(国际通用)多数称之为Florocol和Nuflo5。氟苯尼考化学式为C12H14Cl2FNO4S ,其相对分子质量为358.22,化学构造式6如图1:图1 氟苯尼考构造式1.1.2 药效学 氟苯尼考是属于氯霉素类广谱抗菌药,与氯霉素(CHL)和甲砜霉素(THI)具备相似作用机理和抗菌谱,它可以与细菌有效地特异性结合,可以通过减少有关酶活性从而使肽链延伸
8、受到抑制作用,进而干扰甚至丧失了细菌合成蛋白质功能7。然而,构造修饰与改造令氟苯尼考与CHL和THI相比,明显增强了安全性和有效性。在构造上,氟苯尼考用氟原子取代了CHL和THI中丙烷链上第3个碳原子位置上羟基,从而对菌体蛋白乙酰化反映产生阻碍和抑制作用,进而使氟苯尼考不受有关酶影响,避免了药物灭活。因而,氟苯尼考不容易浮现由质粒介导耐药性,并且对于大量具有耐CHL基因病原体,氟苯尼考仍旧敏感。氟苯尼考对于大多数细菌都具备杀灭或抑制作用,同步对于厌氧革兰氏阳性菌和阴性螺旋体,以及立克次氏体,阿米巴原虫等都具备较为明显抗菌作用5。1.1.3 药动学氟苯尼考在机体内见效快,持续时间长。依照研究者实
9、验得出,肌肉注射氟苯尼考1小时后来,血液中药物浓度可以达到治疗浓度,13 小时后便可以达到高峰期血药浓度。只需一次给药,有效血药浓度便可以维持4872小时以上,并且不会浮现骨髓抑制和再生障碍性贫血危害。氟苯尼考在体内分布广泛,可以透过血脑屏障来抑制和治愈动物细菌性脑膜炎,相比于其她抗菌药,氟苯尼考可具备极强治疗效果。在机体内,某些器官氟苯尼考药物浓度较高,血药浓度可以达到治疗效果,重要通过肝脏、肾脏代谢,少量药物可以随粪便由体内排出。依照动物种类和给药方式不同,氟苯尼考药物代谢动力学会有略微差别。1.1.4 耐药性 由于临床上氟苯尼考用法不当,如今已经开始浮现氟苯尼考耐药菌株,应当即刻引起人们
10、广泛关注。1996 年,Kim 等研究人员第一次发现并且命名了一种可以耐氟苯尼考基因pp-Flo,依照DNA序列分析显示得出,pp-Flo基因有47.4%几率与非酶介导导氟苯尼考耐药基由于同源基因。在此之后,研究者又陆续地克隆出了各种不同氟苯尼考耐药基因,重要是从沙门氏菌、大肠杆菌以及葡萄球菌属中得到,涉及Flo、Flor、FexA 和Cfr等基因。总体来讲,依照当前研究成果,重要有Flo、Flor、FexA、以及Cfr 和pp-Flo9这五种可以耐氟苯尼考基因。1.2 氟苯尼考临床应用氟苯尼考如今已经广泛投入使用在各种水生动物(涉及鱼、虾、蟹、鲍、贝等在内)养殖业中。氟苯尼考可以明显地防止和
11、治疗各种急性、慢性细菌性疾病,例如黄尾鱼假核性巴氏杆菌病及链球菌病、大西洋鲑鱼疖病9、黄尾鱼巴氏杆菌感染、鳗迟钝性爱德华氏菌感染、以及鲑杀鲑弧菌性感染10等。 在猪养殖业中,在防止和治疗猪喘气病、胸膜肺炎与沙门氏菌病,涉及大肠杆菌性下痢、萎缩性鼻炎以及猪丹毒、猪肺疫和无乳综合症等在内疾病中,氟苯尼考具备明显防治效果。对于猪胸膜肺炎放线杆菌,氟苯尼考最小抑菌浓度(MIC)范畴在0.201.56 g/mL之间,它对于猪胸膜肺炎放线杆菌最佳抑菌浓度是0.39 g/mL。相比较于阿莫西林(AMX)以及恩诺沙星这两种药物,氟苯尼考对猪链球菌病治愈率11明显高于两者。氟苯尼考同样广泛地用于防止和治疗牛细菌
12、性疾病2 ,且防治效果是其她同类药物所不能及。氟苯尼考可以用于防治牛呼吸系统疾病12 、牛肠炎13 、牛无名热14。单独使用氟苯尼考时,可以明显地抑制溶血性巴氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和嗜血杆菌三种引起牛呼吸道疾病重要病原体,可以明显地治疗牛呼吸道感染疾病15。值得一提是,各成长阶段肉牛都可以使用氟苯尼考注射剂。当前,氟苯尼考在禽类养殖业细菌性疾病防治中占有着举足轻重地位。依照研究者实验证明,按照15比例,药物浓度50 g/mL来配伍甲氧苄啶( TMP )和氟苯尼考两种药物,即每毫升药液中具有氟苯尼考42 微克,甲氧苄啶8 微克,可以极佳治愈鸡大肠杆菌病16。每12 小时以2040 g/kg剂量肌
13、肉注射给药或者口服给药氟苯尼考一次,持续使用三天,可以较好治疗鸡多杀性巴氏杆菌病,且效果较为明显17。使用氟苯尼考可明显地防止和治疗鸭传染性浆膜炎,实验表白,将氟苯尼考用于同一种群中浮现临床症状病鸭,传染性浆膜炎治愈率平均可以达到96.8%;将氟苯尼考用于同一种群中尚未浮现临床症状鸭种(假定健康鸭),其传染性浆膜炎平均防止有效率达到了97.1%18。如果使用氟苯尼考与多西环素(DOX)复方制剂,效果相称于甚至高于单独配方氟苯尼考可溶性粉19。该复方制剂可以有非常效地抑制鸡大肠杆菌感染且缓和病鸡临床症状,并可以明显减少鸡由大肠杆菌感染引起发病和死亡几率,且在一定限度上,该制剂可以减少成活鸡体重下
14、降。1.3 氟苯尼考检测办法当前,用于检测动物性食品中氟苯尼考含量办法重要使用气象或液相色谱与色谱质谱联用法,其中高效液相色谱法与液相色谱-质谱联用法最为广泛。固然,依照条件、目、用途不同,当前也惯用其她氟苯尼考检测办法,其中重要有电位法、分光光度法、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶束电动毛细管色谱法等。1.3.1 气象色谱(GC)与液相色谱法(LC)使用GC与LC法进行氟苯尼考含量测定期,提取样品中氟苯尼考药物残留重要提取液普通使用乙酸乙酯与甲醇、以及乙腈和丙酮等有机溶剂,其中,乙酸乙酯提取效率最高19。惯用固相萃取柱有C18柱20、HLB柱19、MCX柱21或Florisil柱22等。在使
15、气象色谱法分析之前,需要进行样品前解决反映-硅烷化和酰化,以此来生成热稳定性强并且容易挥发衍生物,普通需要使用氢火焰离子检测器(FID)或者电子捕获检测器(ECD)23来检测衍生化反映完毕之后样品,。使用液相色谱法检测时,色谱柱普通使用是C18柱,检测器普通使用二极管阵列检测器(PDA)19、紫外检测器(UVD)20或者荧光检测器(FLD)21。相比于其她分析办法,高效液相色谱法操作简便,定量精确,成果稳定且消耗时间短,但同步该办法具备敏捷度不高,并且无法提供待测物构造信息缺陷。1.3.2 气象色谱-质谱联用法(GC-MS)和液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)气象色谱-质谱联用法与气
16、象色谱法同样,需要进行衍生化过程,但需要避免水分浮现,水存在会减少衍生化效率,生成产物不稳定。因而,使得GC-MS法前解决过程极为复杂。与之相比,液相色谱-串联质谱联用法具备敏捷度高、选取性好、定量精确以及简便快捷、抗干扰长处,是氟苯尼考含量较为抱负检测办法。使用液相色谱-串联质谱联用法分析不同基质样品时,有时会浮现对基质抑制作用。故而,使用LC-MS/MS检测时,定量办法需要使用内标法,也可以采用以基质来匹配原则曲线法办法来,通过此办法可以提高LC-MS/MS分析办法精确度和精密度24。然而,液相色谱-串联质谱联用法仪器并不普遍,且成本较高,无法得到普及。1.3.3 其她办法a.电位法电位法
17、要将样本在乙醇中溶解,再加入氢氧化钠溶液进行加热回流,经稀释后来,加入稀硝酸,然后使用银-玻璃电极进行滴定。电位法是电化学分析领域重要研究方向之一,该办法定量稳定而精确,但由于其消耗时间过长,操作较为繁琐,不适合迅速分析检测。b.分光光度法 由于氟苯尼考在紫外光区具备吸取特性,可以通过浓度与在特定波长处氟苯尼考光吸取度之间关系,来计算和分析动物性食品中残留氟苯尼考含量。使用分光光度法检测分析操作简便,消耗时间短,但由于干扰因素比较多,导致分光光度法精确度较低,并且专属性较差。c.酶联免疫吸附法(ELISA)酶联免疫吸附法是一种先进可靠分析检测办法,该办法理论基本是应用了抗原与抗体具备可逆性特异
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