液相蛋白芯片关键技术.doc

液相蛋白芯片技术液相蛋白芯片技术由美国纳斯达克上市公司Luminex研制开发并于2O世纪9O年代中期发展起来，是在流式细胞技术、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)技术和老式芯片技术基本上开发新一代生物芯片技术和新型蛋白质研究平台。液相蛋白芯片技术推动了功能基因组时代蛋白质研究，有关仪器、分析软件以及试剂盒研发备受瞩目并已形成一定市场规模。现拟对该技术基本原理、技术特点及其在免疫诊断和分析领域研究和应用状况进行综合简介。一、液相蛋白芯片技术基本原理老式蛋白芯片技术是将蛋白质分子有序地固定在滤膜、滴定板和载玻片等固相载体上，用标记了特定荧光抗体蛋白质等生物分子与芯片作用，再运用荧光或激光扫描技术测定其荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质互相作用，从而达到研究蛋白质功能或免疫诊断目。但固相载体难于维持蛋白质天然构象，不利于蛋白质功能研究。液相芯片技术在国际上被称之为xMAP (flexible MultilyteProfiling) 技术，其核心技术是乳胶微球包被、荧光编码以及液相分子杂交。液相芯片体系以聚苯乙烯微球 ( beads ) 为基质，微球悬浮于液相体系，每种微球可依照不同研究目的定上特定抗体或受体探针，可对同同样品中各种不同分子同步进行检测。微球表面可进行一系列修饰以适合固定各种蛋白、多肽或核酸等生物分子。xMAP技术可应用于蛋白或核酸功能及其互相作用研究，分别称之为液相蛋白芯片技术和液相基因芯片技术。液相蛋白芯片体系重要涉及微球、蛋白探针分子、被检测物和报告分子四种成分。在液相系统中，为了区别不同探针，每一种用于标记探针微球都带有独特色彩编码，其原理是在微球中掺入不同比例红色分类荧光及发色剂，可产生100种颜色差别微球，可标记上100种探针分子，能同步对一种样品中多达100种不同目的分子进行检测。反映过程中，探针和报告分子都分别与目的分子特异性结合。结合反映结束后，使单个微球通过检测通道，使用红、绿双色激光同步对微球上红色分类荧光和报告分子上绿色报告荧光进行检测，可拟定所结合检测物种类和数量。二、液相蛋白芯片技术特点液相蛋白芯片技术有机地整合了微球、激光检测技术、流体动力学、高速数字信号解决系统和计算机运算功能，不但检测速度极快，并且在免疫诊断以及蛋白质分子互相作用分析方面，其特异性和敏感性往往也超越常规技术。其技术特点可归纳如下。1、反映迅速，敏捷度高。反映环境为液相、微球上固定探针与待检样品均在溶液中反映，其彼此间碰撞几率与速度相对于固相芯片或ElISA等反映模式，可增长10倍以上，因而可提高反映速度及敏捷度。抗原-抗体等蛋白质分子互相作用成果可在瞬间经激光鉴定后由电脑以数据信息形式记录下来，敏感性明显超越酶联信号或常规杂交信号检测。2、通量大，可同步检测各种目的物，所需成本较低，减少人力消耗，可对同同样品中多达100种分子同步进行分析。液相芯片系统采用96孔板为反映容器，在3560min内，可对96个不同样品进行检测，所需样品用量比常规办法少。3、可进行多元化分析，灵活性好，可合用于各种蛋白质分析，应用广泛。通过对微球表面修饰，可固定各种抗体或受体分子，从而满足不同检测和功能研究需要。4、采用接近生物系统内部环境完全液相反映体系，稳定性好。液相环境更有助于保持蛋白质天然构象，不但有助于探针和被检测物反映，也更能保证反映特异性和稳定性。5、操作简便，不需洗涤，耗时短。常规ELISA或固相芯片技术，每一步反映之后都需充分洗涤以去除非特异结合成分，耗时且易导致污染。而液相芯片技术可以避免这些过程和弊端。三、液相蛋白芯片在免疫诊断和分析领域应用液相蛋白芯片系统合用于蛋白质组学研究，临床研究和药物研究中各种蛋白质分析，已被应用于细胞因子和激酶检测、抗原决定簇筛选、各种蛋白质过敏原检测、传染病迅速诊断以及与各种抗原、抗体反映有关检测当中。在免疫诊断与分析研究应用方面，全球已有上百篇公开刊登论文和研究报道，重要可归纳为如下几方面。1、传染病迅速检测和疾病诊断：xMAP液相蛋白芯片免疫诊断办法又称为微球免疫办法(microsphereimmunoassay)，国内外已建立各种微球免疫办法用于人和动物传染病迅速检测以及人类疾病诊断研究。Yan等建立微球免疫检测办法进行流感病毒检测和分型，并与EusA办法比较，成果表白微球免疫法对流感病毒粒子和重组血凝素抗原检测敏感性均提高了10倍。Wong等建立微球免疫办法迅速检测西尼罗病毒（WestNilevirus），并能与登革热病毒感染、圣路易斯脑炎(StLousisencephalitis)病毒感染以及黄热病(flavivirus)免疫鉴别开。Biagini等应用液相蛋白芯片技术检测人群血样中抗炭疽IgG抗体，并与ELISA办法相比较，成果表白，前者更加敏感和迅速，稳定性好，样品用量少，检测动力学范畴广。Biagini等还建立液相蛋白芯片办法同步检测血清中23种血清型肺炎球菌荚膜多糖抗体。Pickering等将微球免疫办法应用于检测破伤风(tetanus)、白喉(diphtheria)以及B型嗜血性流感杆菌(haemophilusinfluenzatypeB)疫苗免疫抗体，并与ELISA办法相比较。对81份样品，两种办法对三种疫苗抗体检测符合率可达91%96%，而微球免疫办法能减少人力和试剂消耗，并缩短检测时间。在定量检测方面，国外也有报道。Dias等建立微球免疫办法，用于定量检测抗人乳头瘤病毒6、11、16和18型中和抗原抗体，并依照检测成果拟定用于临床诊断鉴定抗体阈值。Lal等建立微球免疫检测办法，用于同步定量检测抗9种血清型肺炎链球菌IgG抗体，研究表白，微球免疫液相蛋白芯片办法可用于肺炎链球菌疫苗免疫效果评估。此外，国外尚有报道建立液相蛋白芯片办法用于检测艾滋病病毒抗体、疱疹病毒抗体、麻疹和腮腺炎抗体、弓形虫抗体、呼吸道合胞病毒抗体、类风湿因子等以及一种人类医学紊乱症乳糜泻(celiacdiseases)诊断。2、细胞因子检测与研究：应用液相蛋白芯片技术可对微量样品同步定量检测各种细胞因子。在人细胞因子检测和研究方面，液相蛋白芯片技术应用当前已有多篇报道。Skogstrand等应用液相蛋白芯片技术同步检测新生儿干血点样品(dried blood spot samples，DBSS)中25种细胞因子。新生儿炎症反映也许与脑瘫、自闭症和糖尿病等某些迟发疾病关于，对新生儿进行炎症因子检测将有助于上述疾病病原学研究。普通采用DBSS样品进行检测，由于样品量少，采用常规免疫学办法对一份样品难以检测各种因子。而液相芯片办法可解决这个问题。实验表白，液相芯片办法对原则品检测回收率平均可达105，批内和批间检测偏差分别为62和160。采用液相芯片对储存以上样品进行检测，仍能检测到大多数细胞因子。研究表白，液相蛋白芯片应用于检测DBSS样品中细胞因子是可靠，在新生儿疾病筛查方面应用潜力大。Gorelik等应用液相芯片检测人体中24种细胞因子浓度水平，以研究细胞因子水平与卵巢癌初期诊断关系。研究人员对卵巢癌初期患者、健康人群和良性骨肿瘤患者血样，同步检测各种细胞因子和癌症抗原(CA一125)并比较其浓度水平。成果显示，CA125以及白细胞介素IL-6、IL-8等6种标记物浓度水平在卵巢癌初期患者和健康人血样中有明显差别。研究表白，应用液相蛋白芯片检测上述标记物浓度变化可作为卵巢癌初期诊断手段。Johannisson等u应用液相蛋白芯片办法检测猪促炎症细胞因子（proinflammatory cytokines），敏捷度可达0.1812ngml。这是初次报道采用液相蛋白芯片技术检测动物体内细胞因子。3、抗核抗体、抗多肽抗体检测、抗体应答等免疫分析研究：Rouquette等应用液相蛋白芯片检测试剂盒定量检测了9种抗核抗体(antinuclear antibodies)，并与常规ELISA和免疫荧光试剂盒相比较，对222例血清样品检测成果表白，液相芯片办法与常规办法检测符合率介于99.1%100.0%。Komatsu等建立液相蛋白芯片办法，用于检测抗多肽抗体，以监测多肽疫苗免疫应答状况；检测表白，液相芯片办法敏感性与商品化ELISA试剂盒相称，但前者所需样品量少，检测时间缩短，成本较低。Khan等建立液相蛋白芯片办法，用于进行淋巴细胞胞内信号通道研究。该办法可以检测信号转导过程中T细胞和B细胞胞内发生信号蛋白磷酸化动力学变化，从而可揭示淋巴细胞信号通道作用机制。实验表白，液相芯片办法可同步检测各种信号蛋白动力学动态变化过程。Williams等应用液相蛋白芯片办法检测患者血样中各种异嗜性抗体(heterophilantibodies)，分析了艾滋病免疫检测中假阳性反映产生因素，为排除假阳性反映提供理解决办法。研究人员建立了同步检测抗牛、羊、鼠以及牛血清白蛋白IgG抗体液相芯片办法，对多例患者血清进行检测实验，成果表白，在常规检测中浮现非特异性染色反映样品，均不同限度存在上述异嗜性抗体。将样品事先与上述抗体孵育后再进行液相芯片检测或ELISA常规检测，可以排除非特异反映。四、存在问题与应用展望如上所述，液相蛋白芯片由于高通量、自动化、迅速、敏感以及多元化等特点，在生命科学研究中将得到广泛应用，可预见，研究、临床检查等方面巨大需求将带动规模可观生物芯片研发与销售市场，特别是在临床和诊断市场上，临床检查和诊断芯片将有远大前景。在临床诊断方面，高质量诊断用抗原、单克隆抗体缺少、昂贵研制和商业价格将是制约液相蛋白芯片开发和应用重要因素。此外，芯片仪器设备价格较高，研究和开发人员对液相芯片技术、设备选取和使用等缺少足够理解，商品化液相芯片试剂盒缺少等，这些因素在当前都将影响到这一新兴技术广泛应用。然而，液相蛋白芯片技术由于其技术特点，具备巨大发展潜力，在当前以及将来相称时期内都将是全球分子生物学科学研究和应用领域热点生物技术手段。液相蛋白芯片技术将日臻成熟完善，成本将减少，各种诊断和研究用液相蛋白芯片商业化生产，以及液相蛋白芯片技术服务市场形成指日可待。