东京四照花钙组分与渗透调节物质对盐胁迫的响应_袁佳秋.pdf
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1、生态环境学报 2023,32(4):687-696 http:/ Ecology and Environmental Sciences E-mail: 基金项目:江苏省林业科技创新与推广项目(LYKJ201806);江苏省高校重点学科建设项目(PAPD);江苏省研究生科研实践与创新计划项目(KYCX21_0888)作者简介:袁佳秋(1994 年生),女,讲师,博士研究生,主要从事抗逆机制研究。E-mail: *通讯作者,E-mail: 收稿日期:2023-03-03 东京四照花钙组分与渗透调节物质对盐胁迫的响应 袁佳秋1,2,孙大伟2,杨玲3,洑香香2*1.江苏食品药品职业技术学院,江苏 淮安
2、 223005;2.南方现代林业协同创新中心/南京林业大学林学院,江苏 南京 210037;3.上海市野生动植物和自然保护地研究中心,上海 200336 摘要:随着滨海地区土壤盐渍化程度不断扩大,选育耐盐性和观赏价值并存的木本植物进行引种栽培,将有利于盐渍土壤资源的利用和生态系统的改善。东京四照花(Cornus hongkongensis subsp.tonkinensis)作为观赏型苗木,从幼苗的钙组分与渗透物质方面探讨其盐胁迫响应机制,为其在滨海地区推广种植提供理论依据。设置 4 种质量分数梯度的盐浓度:0(CK)、0.20%(T1)、0.30%(T2)和 0.45%(T3),水培法培养幼
3、苗。盐处理幼苗的盐害等级(ISD)随着盐分浓度的升高和胁迫时间的延长而增加。盐胁迫 5 d 时,各处理组的幼苗 ISD和成活率未有明显变化;盐胁迫 30 d 时,T1、T2 和 T3 处理组的 ISD分别为 47.80%、52.00%和 71.20%,对应的成活率分别为 82.60%、84.00%和 56.00%。胁迫初期(5 d),T1、T2 和 T3 保卫细胞中 Ca2+浓度较CK 分别增加了 13.98%、22.54%和 17.33%。同时,T1、T2 和 T3 的气孔孔径的宽长比(W/L)比 CK 分别减少了 23.60%、25.98%和 36.05%。其中,仅 T3 处理保卫细胞中
4、Ca2+浓度随胁迫时间延长而显著升高。胁迫至 30 d,T3 处理下的水溶性钙(H2O-Ca)、草酸钙(HCl-Ca)、果胶酸钙(NaCl-Ca)质量分数分别降低至 4.99、7.12、4.04 mgg1。同时,随着盐浓度的升高,草酸钙晶体在叶肉细胞中破碎化程度明显。与 CK 相比,T1、T2 和 T3 草酸钙晶体在叶肉细胞中面积占比分别显著降低了 43.10%、15.25%、69.90%。T3 处理下的可溶性蛋白(SP)、可溶性糖(SS)和脯氨酸(Pro)含量较 CK 分别增加了 20.04%、15.38%和 19.74%。东京四照花短期(30 d)可承受 0.45%的盐胁迫。幼苗通过提高
5、Ca2+浓度,促进可溶性蛋白的合成来提高其耐盐性。此外,草酸钙降解释放出的 Ca2+可能是缓解盐胁迫对东京四照花幼苗损伤的有效策略。关键词:盐胁迫;钙组分;草酸钙;渗透物质;东京四照花 DOI:10.16258/ki.1674-5906.2023.04.006 中图分类号:Q945;X17 文献标志码:A 文章编号:1674-5906(2023)04-0687-10 引用格式:袁佳秋,孙大伟,杨玲,洑香香,2023.东京四照花钙组分与渗透调节物质对盐胁迫的响应J.生态环境学报,32(4):687-696.YUAN Jiaqiu,SUN Dawei,YANG Ling,FU Xiangxiang
6、,2023.Responses of Calcium Composition and Osmotica under Salt Stress in Cornus hongkongensis Subsp.Tonkinensis(W.P.Fang)Q.Y.Xiang J.Ecology and Environmental Sciences,32(4):687-696.盐胁迫是主要的非生物胁迫之一,制约植物生长、发育和产量(Jafari et al.,2019)。盐胁迫主要对植物产生离子毒害和渗透胁迫,导致细胞内部代谢失衡(Farooq et al.,2017)。一方面,植物会通过限制 Na+吸收、促
7、进 Na+外排及区隔化,以避免毒害;并维持胞内适当的 K+和 Ca2+浓度来保持离子平衡(Tuna et al.,2007)。另一方面,植物通过积累有机(脯氨酸 Pro、可溶性糖 SS、可溶性蛋白 SP 等)或无机物质(Na+、K+和 Cl等)以提高细胞液浓度,降低渗透势,保证植物水分的正常吸收(Zhang et al.,2021)。植物遭遇盐胁迫时,会触发胞质游离 Ca2+(Ca2+cyt)的增加,从而刺激 Ca2+相关的盐过度敏感(SOS)途径排出细胞内过量的 Na+(Zhang et al.,2022)。下游的Ca2+cyt作为第二信号,激活钙依赖蛋白激酶(CDPKs)和盐敏感通道,并将
8、高渗透信号传导到下游的基因转录和蛋白活性(Deinlein et al.,2014)。有研究结果表明,保卫细胞中 Ca2+浓度的升高通常会导致气孔的关闭(张国显,2015);而气孔的关闭则会引起蒸腾速率(Tr)的下降,加快净光合速率(Pn)的下降(鲁强等,2020)。在植物体中,总钙分为游离态的钙离子和结合态的钙盐,且茎叶中较根部或果籽中含量较多(徐静静等,2012)。结合态钙是 Ca2+与植物体内不同化学物质结合,形成易溶、微溶或难溶于水的钙盐,如水溶性钙、果胶酸钙、磷酸钙及碳酸钙、草酸钙等(张688 生态环境学报 第32卷第4期(2023年4月)国显,2015)。其中,水溶性钙代谢快,可迅
9、速转变为其他形态的钙;果胶酸钙在维持细胞壁功能和细胞膜的稳定性具有重要作用(曹建华等,2011;马建军等,2012)。而草酸钙和大部分磷酸钙以沉淀形式存在,作为植物的“钙库”。张国显(2015)研究表明,低温胁迫降低叶片中果胶酸钙、磷酸钙和碳酸钙、草酸钙的质量分数,这说明低温胁迫减小了细胞内的钙库。而王光野等(2018)研究表明,盐碱土壤导致的盐胁迫可引起植物体内 Ca2+浓度升高,过多的 Ca2+与草酸在液泡中结合成草酸钙晶体,以避免过高 Ca2+浓度对细胞造成毒害作用。综上,在逆境下植物体内的结合态钙对维持细胞的生理活动发挥着重要作用,但盐胁迫下钙在不同生理水平上的调节机制尚不清楚。中国江
10、苏省滨海盐渍土壤类型属于沿海半湿润盐碱地区,表层土壤盐分在 0.20%0.50%,土壤pH 偏碱性(Zhang et al.,2010)。而改良盐碱地的重要措施之一就是引种栽培耐盐植物。对于景观设计者来说,在植物正常生长的情况下保持其较高的观赏价值是首要关注的问题。那么,四照花(Cornus spp.)为山茱萸科(Cornaceae),常绿或落叶小乔木或灌木,集观叶、观花、观果于一身,是具有良好发展前景的园艺观赏树种(Fu et al.,2013)。四照花分为东亚和北美两大类群(洑香香等,2015);其中,东亚四照花原产于中国的亚热带地区,其对干旱、高温和病虫害胁迫的抗性比北美四照花更强(鲁强
11、等,2019;Lu et al.,2020)。根据室内试验和大田适应性栽培试验,发现东亚类四照花在中等盐度(0.20%0.30%)下生长良好(Lu et al.,2021)。其 中,东 京 四 照 花(C.hongkongensis subsp.tonkinensis)因其叶色变异较丰富,是东亚四照花类群中具有潜在观赏价值的常绿树种。因此,选育耐盐性和观赏价值并存的木本植物进行引种栽培,将有利于盐渍土壤资源的利用和生态系统的改善。然而,东京四照花对盐胁迫的具体适应机理还不清楚,因此,本文拟开展如下研究:(1)探究保卫细胞中的 Ca2+盐敏感度;(2)在生理水平上探究钙组分、渗透调节对盐胁迫的响
12、应;(3)在解剖结构上探究草酸钙晶体的变化规律。1 材料与方法 1.1 试验材料 试验材料为 2 年生东京四照花实生苗(苗高:80150 cm;平均地径:7.50 mm)。用于育苗的东京四照花种子采自江苏省南京市溧水区无想寺四照花园(119253N,313522E)。采用无纺布袋容器育苗,育苗基质配比(体积比)为黄棕壤:泥炭土:蛭石=5:3:2,苗期常规管理。1.2 试验设计 本研究于 2021 年 69 月在南京林业大学的一个半开放温室中进行。于 2021 年 6 月将 2 年生大小均匀的幼苗从容器中移植到水培箱(50 L)预培养 2 个月(1/2 Hoagland 改良营养液:2.50 m
13、molL1 Ca(NO3)24H2O、2.50 mmolL1 KNO3、0.50 mmolL1 NH4NO3、1.00 mmolL1 MgSO47H2O、30.65 molL1 C10H12FeN2NaO8、23.13 molL1 H3BO3、4.57 molL1 MnCl24H2O、0.38 molL1 ZnSO47H2O、0.10 molL1 CuSO45H2O 和 0.28 molL1 H2MoO4,调整 pH 6.0),24 h 通气,直至幼苗长出新根、新叶后,进行盐胁迫处理。根据大丰林场 3 年的适应性栽培结果,及鲁强等(2020)的研究结果,本试验将来自黄海的粗海盐(主要成分为:C
14、l、Na、S、Mg、Ca、K、C、Br、Sr、B、F)与营养液相结合来模拟淮河地区沿海盐渍环境。设置 4 个质量分数梯度海盐浓度:0(CK)、0.20%(T1)、0.30%(T2)、0.45%(T3),相应的电导率(EC)测量值分别为 1.06、4.22、5.69、7.95 mScm1(对应浓度 NaCl 标样的电导率分别是:0.00、4.03、5.87、8.73 mScm1)。为降低盐浓度对植物生长的冲击,以每天递增 0.15%分次加盐,逐步达到各处理预设浓度,共计 3 天。随后,每 7 天更换 1 次含对应盐浓度的营养液,每天观测并补充水培箱内损失水量以保证营养液和后续盐处理的盐分浓度相对
15、稳定。每个处理 3 个重复,每重复 12株幼苗。盐处理第 5 和 30 天时,调查盐害等级及存活率;同时,采集幼苗的中上部成熟叶片(每个重复中随机 3 株混样计 1 重复),用于钙指标和渗透调节物质的测定。1.3 指标测定方法 1.3.1 盐害等级(ISD)判定及成活率调查 根据叶片损伤的面积比大小分为以下 5 个盐害级别(Zhong et al.,2019):I.无损害:健康植株,叶片上未出现损害症状;II.初级损伤:老叶边缘和尖端呈发黄和干燥现象,新叶无损伤症状;III.中等损伤:老叶上出现黄变干枯症状面积小于 1/3,或在嫩枝上出现干枯;IV.高度损伤:黄变干枯面积超过1/3,新芽几乎完
16、全干燥;V.急性损伤:老叶几乎完全干燥且开始脱落,并在主枝上出现干枯症状;或者濒临死亡(图 1)。通过统计不同胁迫时间下对应盐害等级的株数,根据下列公式计算盐害指数(Salt Damage Index,ISD)。成活率(Survival rate,RS)即成活株数与总株数之比。ISD=(xn)/(NLN)100(1)袁佳秋等:东京四照花钙组分与渗透调节物质对盐胁迫的响应 689 式中:x每个盐害等级的级别数,IV 即 15;n对应各盐害级别的株数;NL盐害等级的个数,NL=5;N各处理的总株数。1.3.2 叶片保卫细胞中 Ca2+分布 叶片保卫细胞中 Ca2+的分布,参照王学奎和黄见良(201
17、5)的方法测定。撕取叶片下表皮条,放置含有20 mL1 Ca2+荧光探针Fluo-3AM缓冲液中(索莱宝科技有限公司,北京);37 避光培养 30 min,后转移到室温条件下恢复光照 30 min。随后,用 HEPES buffer saline 缓冲液漂洗已经装载 Ca2+荧光探针的叶片下表皮,3 次,每次 35 min,清除掉叶表皮多余的荧光剂。将处理好的叶片下表皮轻置于载玻片上,滴上荧光猝灭剂,盖上载玻片,于荧光显微镜(Nikon DYF-700,Nikon,日本)下观察。采用 488 nm 的激发波长激发表皮条,获得保卫细胞的荧光图片,并用 ImageJ 分析其荧光强度的动态变化(Je
18、nsen,2013)。1.3.3 叶片气孔开度的观测 选取成熟叶片,切取 0.50 cm0.50 cm 大小的方块(包含主脉),固定于 2.50%戊二醛固定液。经过脱水-干燥-喷金,在 QUANTA 200 环境扫描电镜(FEI 公司,美国)下观察叶片气孔形态。对孔径长度(L)、孔隙宽度(W)及宽长比(G,width/length)进行测量,每个重复选取 12 个视野,取均值。1.3.4 叶片不同形态钙质量分数测定 钙组分的测定参照 Ohta et al.(1970)并进行改良,测定的钙组分包括水溶性钙(H2O-Ca)、果胶酸钙(NaCl-Ca)、磷酸钙及碳酸钙(HAc-Ca)和草酸钙(HCl
19、-Ca)。称取 0.10 g 叶片干样,依次加入不同提取液各 5 mL,即蒸馏水、1 molL1 NaCl、2%HAc和 0.60 molL1 HCl,分别提取水溶性钙(H2O-Ca)、果胶酸钙(NaCl-Ca)、磷酸钙及碳酸钙(HAc-Ca)和草酸钙(HCl-Ca)。恒温震荡提取 18 h,8000 rpmmin1离心并倾出上清液;重复提取两次,每次再加入 2 mL 提取剂提取 2 h;将所有提取液合并并定容至 10 mL。利用原子吸收光谱仪(AA900T,Perkin Elmer 公司,美国)测定波长为 422.67 nm 各对应形态钙的质量分数。1.3.5 叶片草酸钙形态与分布观察 草酸
20、钙晶体方法参照苏志孟等(2019)。将叶片剪成大小为 0.50 cm0.50 cm 的方块(包含主脉),于 3%的次氯酸钠溶液中脱色;待叶片变为白色后,转移至饱和水合氯醛溶液中,放置 24 h 至叶片成透明状。最后,于 Nikon 80i 光学显微镜(尼康,日本)观察,拍照。利用 ImageJ 统计图片中草酸钙晶体的数量及占比面积。1.3.6 渗透调节物质含量的测定 采用磺基水杨酸法(李合生,2006)测定脯氨酸(Pro);采用蒽酮比色法(李合生,2006)测定可溶性糖(SS);采用考马斯亮蓝 G-250 法(李合生,2006)测定可溶性蛋白(SP)。1.4 数据处理 用 IBM SPSS 2
21、1.0 对试验数据进行处理分析,并用Origin 2017作图。采用邓肯新复极差法(DMR)检 验、独 立 样 本 T 检 验 和 单 因 素 方 差分析(ANOVAs)进行显著性比较,并通过 Pearson 相关分析,分析各个指标间的关系。所有差异以 P0.05为差异显著、P0.01 为差异极显著,所有参数均表示为均值SD(n=3)。2 结果与分析 2.1 盐胁迫对幼苗的盐害症状 盐胁迫 5 d 时,各处理组的 ISD与 CK 相比,均无明显差异(图 2)。盐胁迫 30 d 后,T1、T2 及 T3处理组的 ISD分别为 47.80%、52.00%和 71.20%,对应成活率分别为 82.6
22、0%、84.00%和 56.00%(图 2);I II III IV V I.无损害;II.初级损伤;III.中等损伤;IV.高度损伤;V.急性损伤 图 1 盐胁迫 30 d 下东京四照花叶片盐损伤症状 Figure 1 Salt stress damage symptoms in leaves of C.hongkongensis subsp.tonkinensis for 30 days 690 生态环境学报 第32卷第4期(2023年4月)与 CK 相比,各处理组的 ISD和 RS分别急剧上升和下降,且 T3 的 ISD高出 196.70%,其相应的 RS降低了 44.00%。随着盐害等
23、级的增加,盐害症状从叶尖端向叶片基部、从边缘向中心扩展(图 1)。随着盐浓度的升高,盐损伤指数显著上升,而存活率显著下降。2.2 盐胁迫对叶片保卫细胞钙离子浓度的影响 通过对叶片保卫细胞钙离子进行 Fluo-3AM 荧光染色,收集荧光强度初步判断保卫细胞游离态Ca2+浓度(图 3)。盐胁迫 5 d 时,T1、T2 和 T3 保卫细胞靠近气孔侧的细胞壁处荧光强度较 CK 分别增强了 13.98%、22.54%和 17.33%(图 4),T2 增强较为显著(P0.05)。胁迫 30 d 时,与 CK 相比,T1 处理下叶片保卫细胞中 Ca2+平均荧光强度明显减弱,降幅为 10.16%;而 T3 处
24、理保卫细胞中 Ca2+平均荧光强度依旧增强,增幅为 13.62%。相比较而言,仅高浓度盐处理(T3)5 d 和 30 d 时 Ca2+浓度 用荧光显微镜观察对照和盐处理后荧光 Fluo-3AM 染色叶中的 Ca2+。(a 和 i)CK 处理、(b 和 j)T1 处理、(c 和 k)T2 处理和(d 和 l)T3 处理的叶片下表皮图像,(e、f、g 和 h)和(m、n、o 和 p)分别为盐处理 5 d 和 30 d 时红色框内对应的气孔放大图,所有处理中均可见 Ca2+在保卫细胞周围的定位。标尺为 50 m 图 3 盐胁迫下东京四照花叶片保卫细胞 Ca2+分布 Figure 3 Ca2+dist
25、ribution in guard cells of leaves in C.hongkongensis subsp.tonkinensis under salt stress 方块代表第五天的数据,三角代表第 30 天的数据;实线代表盐损伤指数,虚线代表成活率。CK、T1、T2、T3 分别表示 4 种质量分数的海盐浓度,依次为 0%、0.20%、0.30%、0.45%。下同 图 2 不同盐浓度下东京四照花盐损伤指数和成活率 Figure 2 Salt damage index(ISD)and survival rate of C.hongkongensis subsp.tonkinensis
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