考点一基因综合项目工程的概念及操作工具.doc

考点一　基因工程概念及操作工具(5年13考)
(天津、福建、重庆、浙江、江苏；新课标、天津、北京、山东、江苏、海南；全国大纲卷、广东……)

一、基因工程概念
基因工程别名
基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境
生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
原理
基因重组
基本过程
剪切→拼接→导入→表达
成果
人类需要基因产物或生物类型
供体
提供目基因
受体
表达目基因
本质
目基因在受体体内表达
长处
可定向改造生物遗传性状
二、DNA重组技术基本工具
1．限制性核酸内切酶(简称：限制酶)

2．DNA连接酶
惯用类型
E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
功能
连接黏性末端
连接黏性末端或平末端
成果
都缝合磷酸二酯键，如图

3.载体
(1)种类：质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
(2)质粒特点

1．下图为限制酶和DNA连接酶关系，据图回答：

(1)限制酶和DNA连接酶作用部位相似吗？相似。
(2)DNA连接酶起作用时与否需要模板？不需要。
2．探究载体所具条件意义
条　件
意　义
稳定并能自我复制
目基因稳定存在且数量可扩大
有一种至各种限制酶切割位点
可携带各种或各种外源基因
具备特殊标记基因
便于重组DNA鉴定和选取

基因工程操作工具综合考查
(典型高考题)依照基因工程关于知识，回答下列问题：
(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生片段如下：
AATT C……G
G……CTTAA
为使运载体与目基因相连，具有目基因DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必要具备特点是______________________________。
(3)按其来源不同，基因工程中所使用DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。
(4)反转录作用模板是________，产物是_____________________________________。
若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。
(5)基因工程中除质粒外，________和________也可作为运载体。
(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，普通状况下，不能直接用未解决大肠杆菌作为受体细胞，因素是____________________________________________________________________。
1．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等有关酶分析比较
名称
作用部位
作用底物
作用成果
限制酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA切成两个片段
DNA连接酶
磷酸二酯键
DNA片段
将两个DNA片段连接为一种DNA分子
DNA聚合酶
磷酸二酯键
脱氧核苷酸
DNA
DNA酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间氢键
DNA
将双链DNA分子局某些解为两条长链
RNA聚合酶
磷酸二酯键
核糖核苷酸
将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端
2.限制酶选取注意事项

(1)依照目基因两端限制酶切点拟定限制酶种类
①应选取切点位于目基因两端限制酶，如图甲可选取PstⅠ。
②不能选取切点位于目基因内部限制酶，如图甲不能选取SmaⅠ。
③为避免目基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同限制酶切割目基因和质粒，如图甲也可选取用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要保证质粒上也有这两种酶切点)。
(2)依照质粒特点拟定限制酶种类
①所选限制酶要与切割目基因限制酶相一致，以保证具备相似黏性末端。
②质粒作为载体必要具备标记基因等，因此所选取限制酶尽量不要破坏这些构造，如图乙中限制酶Sma Ⅰ会破坏标记基因；如果所选酶切点不是一种，则切割重组后也许丢失某些片段，若丢失片段含复制起点区，则切割重组后片段进入受体细胞后不能自主复制。
1.如图为DNA分子在不同酶作用下所发生变化，图中依次表达限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用对的顺序是(　　)

A．①②③④　　　　　 B．①②④③
C．①④②③ D．①④③②
2.若要运用某目基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理是(　　)

A．用EcoRⅠ切割目基因和P1噬菌体载体
B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目基因和P1噬菌体载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目基因和P1噬菌体载体
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目基因和P1噬菌体载体
3.已知一双链DNA分子，用限制酶Ⅰ切割得到长度为120 kb(kb：千碱基对)片段；用限制酶Ⅱ切割得到40 kb和80 kb两个片段；同步用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到10 kb、80 kb和30 kb 3个片段。据此分析该双链DNA分子构造及酶切位点状况为(　　)

4.下列关于载体论述中，错误是(　　)
A．载体与目基因结合后，实质上就是一种重组DNA分子
B．对某种限制酶而言，载体最佳只有一种切点，但还要有其她各种酶切点
C．当前惯用载体有质粒、λ噬菌体衍生物和动植物病毒
D．载体具备某些标记基因，便于对其进行切割

考点二　基因工程基本操作程序及应用(5年24考)
(新课标Ⅰ、福建、天津、四川、海南、江苏；新课标、天津、广东、重庆、北京、山东、江苏、海南；新课标Ⅰ、福建……)

1．操作环节：获取目基因→构建基因表达载体→将目基因导入受体细胞→目基因检测与鉴定。
2．应用
技术名称
应用
植物基因工程
哺育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物，运用转基因改良植物品质
动物基因工程
提高动物生长速度，改进畜产品品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植供体
基因治疗
把正常基因导入病人体内，使其表达产物发挥作用，从而治疗疾病，分为体内基因治疗和体外基因治疗

1．观测基因工程操作过程，分析每一环节操作程序

↓

↓

↓

2．目基因检测和鉴定

3．探究基因治疗与基因诊断不同点

原理
操作过程
进展
基因治疗
基因表达
运用正常基因导入有基因缺陷细胞中，以表达出正常性状来治疗
临床实验
基因诊断
碱基互补配对
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带状况
临床应用

基因工程操作程序考查
(·四川卷)将苏云金杆菌Bt蛋白基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫转基因棉，其过程如下图所示(注：农杆菌中Ti质粒上只有T­DNA片段能转移到植物细胞中)。

(1)过程①需用同种____________酶对含Bt基因DNA和Ti质粒进行酶切。为将过程②获得含重组质粒农杆菌筛选出来，应使用________培养基。
(2)过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让________进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素培养基上继续培养，目是________________________________________________________________________。
(3)若过程④仅获得大量根，则应在培养基中增长________以获得芽；某些接种在无激素培养基上芽也能长根，因素是_________________________________________。
(4)检查转基因棉抗虫性状，惯用办法是____________。种植转基因抗虫棉能减少________使用，以减轻环境污染。
1.下图表达用化学办法合成目基因Ⅰ过程。据图分析，下列论述对的是(　　)

A．过程①需要DNA连接酶
B．过程②需要限制性核酸内切酶
C．目基因Ⅰ碱基序列是已知
D．若某质粒能与目基因Ⅰ重组，则该质粒和目基因Ⅰ碱基序列相似
2.下列用于判断目基因与否转移成功办法中，不属于分子检测是(　　)
A．通过害虫吃棉叶看其与否死亡
B．转基因生物基因组DNA与DNA探针能否形成杂交带
C．转基因生物中提取mRNA与DNA探针能否形成杂交带
D．转基因生物中提取蛋白质能否与抗体形成杂交带
3.(·天津卷)为达到相应目，必要通过度子检测是(　　)
A．携带链霉素抗性基因受体菌筛选
B．产生抗人白细胞介素­8抗体杂交瘤细胞筛选
C．转基因抗虫棉植株抗虫效果鉴定
D．21三体综合征诊断
4.(·福建卷)GDNF是一种神经营养因子，对损伤神经细胞具备营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因表达载体(如图1所示)，并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗研究。请回答：

(1)在分离和培养大鼠神经干细胞过程中，使用胰蛋白酶目是__________________。
(2)构建含GDNF基因表达载体时，需选取图1中________限制酶进行酶切。
(3)经酶切后载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到载体重要有3种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接(如图1所示)。为鉴定这3种连接方式，选取HpaⅠ酶和BamHⅠ酶对筛选得到载体进行双酶切，并对酶切后DNA片段进行电泳分析，成果如图2所示。图中第________泳道显示所鉴定载体是正向连接。
(4)将正向连接表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因与否成功表达，可用相应________与提取蛋白质杂交。当培养神经干细胞达到一定密度时，需进行________培养以得到更多数量细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。
考点三　蛋白质工程、转基因技术安全性及生物武器(5年6考)
(新课标Ⅱ、海南；重庆；广东、江苏……)

1．概念理解
蛋白质工程
详细内容
别称
第二代基因工程
目的
生产符合人类生产和生活需要一种新蛋白质
原理
由于基因决定蛋白质，因而要对蛋白质构造进行改造，必要从基因入手
基本
蛋白质分子构造规律及其与生物功能关系
手段
基因修饰或基因合成，对既有蛋白质进行改造，或制造一种新蛋白质
核心技术
基因工程
基本
蛋白质分子构造规律及其与生物功能关系
成果
改造了既有蛋白质或制造出新蛋白质
2.操作过程
从预期蛋白质功能出发→设计预期蛋白质构造→推测应有氨基酸序列→找到相相应脱氧核苷酸序列(基因)→基因表达→产生需要蛋白质。
3．转基因技术安全性
(1)安全性问题
①食物安全：滞后效应、过敏原、营养成分变化等。
②生物安全：对生物多样性影响等。
③环境安全：对生态系统稳定性影响等。
(2)理性看待转基因技术
①需要对的社会舆论导向：趋利避害，不能因噎废食。
②制定政策和法规，最大限度保证转基因技术和产品安全性。
4．生物武器
(1)生物武器种类(连线)

(2)生物武器特点
①致病力强、传染性大，②污染面广、危害时间长，③难以防治，④具备一定潜伏期，⑤受自然条件影响大。

探究蛋白质工程与基因工程区别和联系
项目
蛋白质工程
基因工程
区别
过程
预期蛋白质功能→设计预期蛋白质构造→推测应有氨基酸序列→推测相相应脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质
获取目基因→构建基因表达载体→将目基因导入受体细胞→目基因检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需要蛋白质
定向改造生物遗传特性，以获得人类所需生物类型或生物产品
成果
生产自然界中没有蛋白质
生产自然界中已有蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程基本上延伸出来第二代基因工程，由于对既有蛋白质改造或制造新蛋白质，都必要通过基因修饰或基因合成来实现

蛋白质工程考查
(·全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸构成。如果将P分子中158位丝氨酸变成亮氨酸，240位谷氨酰胺变成苯丙氮酸，变化后蛋白质(P1)不但保存P功能，并且具备酶催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要变化蛋白质功能，可以考虑对蛋白质________________进行改造。
(2)以P基因序列为基本，获得P1基因途径有修饰________基因或合成________基因。所获得基因表达时是遵循中心法则，中心法则所有内容涉及________________复制；以及遗传信息在不同分子之间流动，即：________________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过____________和____________进而拟定相相应脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质生物________________进行鉴定。
1．转基因生物存在安全性问题因素
(1)当前对基因构造、调控机制及基因间互相作用理解有限。
(2)目基因往往是异种生物基因。
(3)外源基因插入宿主细胞基因组部位往往是随机。
2．转基因生物优缺陷
长处
缺陷
①解决粮食短缺问题；
②大大减少农药使用量，减少环境污染；
③增长食物营养，提高附加值；
④增长食物种类，提高食物品质；
⑤提高生产效率，带动有关产业发展
①也许浮现新过敏原或重组形成新病毒；
②也许产生抗除草剂杂草；
③也许使疾病传播跨越物种障碍；
④也许会损害生物多样性；
⑤也许会对人类生活环境导致二次污染

1.(典型高考题)下列关于转基因生物安全性论述中，错误是(　　)
A．国内已经对转基因食品和转基因农产品强制实行了产品标记制度
B．国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明也许危害
C．开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全前提
D．当前对转基因生物安全性争论重要集中在食用安全性和环境安全性上
2.(·海南卷)在体内，人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原肽链，此肽链在内质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原，进入高尔基体胰岛素原经酶乙切割去除中间片段C后，产生A、B两条肽链，再经酶丙作用生成由51个氨基酸残基构成胰岛素。当前，运用基因工程技术可大量生产胰岛素。回答下列问题：
(1)人体内合成前胰岛素原细胞是________，合成胰高血糖素细胞是________。
(2)可依照胰岛素原氨基酸序列，设计并合成编码胰岛素原____________序列，用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载体。再通过细菌转化、筛选及鉴定，即可建立能稳定合成____________基因工程菌。
(3)用胰岛素原抗体检测该工程菌培养物时，培养液无抗原抗体反映，菌体有抗原抗体反映，则用该工程菌进行工业发酵时，应从________中分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶解决便可转变为胰岛素。
巧辨基因工程操作基本工具8个易错点
(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)限制酶成分为蛋白质，其作用发挥需要适当理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
(3)在切割目基因和载体时规定用同一种限制酶，目是产生相似黏性末端。
(4)将一种基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同步产生4个黏性末端。
(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生黏性末端都相似，同一种DNA分子用不同限制酶切割，产生黏性末端普通不相似。
(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。
(7)基因工程中载体与细胞膜上物质运送载体不同。基因工程中载体是DNA分子，能将目基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜通透性关于。
(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。
规避与基因工程操作关于7个失分点
(1)目基因插入位点不是随意：基因表达需要启动子与终结子调控，因此目基因应插入到启动子与终结子之间部位。
(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。
(3)原核生物作为受体细胞长处：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。
(4)转化实质是目基因整合到受体细胞染色体基因组中。
(5)普通状况下，用同一种限制酶切割质粒和具有目基因片段，但有时可用两种限制酶分别切割质粒和目基因，这样可避免质粒和质粒之间、目基因和目基因之间连接。
(6)不熟悉标记基因种类和作用：标记基因作用——筛选、检测目基因与否导入受体细胞，常用有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色物质)等。
(7)还应注意问题有：①基因表达载体中，启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)；终结子(DNA片段)≠终结密码子(RNA)。②基因表达载体构建是最核心、最核心一步，在体外进行。
7.(·重庆垫江一模)草甘膦是一种广谱除草剂，其除草机制是抑制植物体内EPSPS酶合成，最后导致植物死亡。但是，它使用有时也会影响到植物正常生长。当前，已发现可以从一种抗草甘膦大肠杆菌突变株中分离出EPSPS基因，若将该基因转入植物细胞内，从而获得转基因植物就能耐受高浓度草甘膦。取6株植物，其中，植物A和D对草甘膦敏感，B和E对草甘膦天然具备抗性，C和F则通过了转基因解决，但是与否成功尚未知。图1为4种限制酶辨认序列和酶切位点，图2为具有目基因DNA片段及其具备限制酶切点。据图回答下列问题：

图1

(1)若A～C浇清水，D～F浇水中具有草甘膦，上述植物中，必定能健康成长是________。
(2)若要从大肠杆菌中筛选出含EPSPS基因突变菌株甲，在大肠杆菌培养基中还必要加入________________。
(3)一种完整基因表达载体除了具备复制原点、启动子和终结子外，还应涉及________和________。
(4)若需运用酶切法获得目基因，最应选取限制酶是________和________。
(5)通惯用________________法将EPSPS基因导入植物体内。假设EPSPS基因已被成功转移到植物F中，但植物F仍没有体现出抗性，分析也许因素______________________。
8.图1表达具有目基因DDNA片段长度(bp即碱基对)和某些碱基序列。图2表达一种质粒构造和某些碱基序列。既有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们辨认碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：

(1)图1一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由________________连接。
(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生末端是________末端，其产物长度为________________________________________________________________________。
(3)若图1中虚线方框内碱基对被T－A碱基对替代，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其相应DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度DNA片段。
(4)若将图2中质粒和目基因D通过同种限制酶解决后进行连接，形成重组质粒，那么应选用限制酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒大肠杆菌，普通需要用添加________培养基进行培养。经检测，某些具有重组质粒大肠杆菌菌株中目基因D不能对的表达，其最也许因素是________________________________________。