共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色.ppt

共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色德国德国Leica激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜SP5 II简介简介22020/11/30基本参数基本参数型号：德国型号：德国Leica SP5 II激光器：激光器：4个个 发射波长发射波长400nm-800nm物镜：物镜：10倍倍 20倍倍 63倍倍通道：多通道通道：多通道 多色多色系统：系统：windows 7LAS AF 活体细胞装置：配有活体细胞装置：配有32020/11/30激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜的基本特点的基本特点l 观察方式：以荧光为主观察方式：以荧光为主l 光源：激光（紫外、可见光）光源：激光（紫外、可见光）l 照明方式：点照明、逐点扫描照明方式：点照明、逐点扫描l 成像方式：共聚焦、逐点成像成像方式：共聚焦、逐点成像l 输出：实时观测，数字化图像，可以进行输出：实时观测，数字化图像，可以进行 图像处理和定量分析图像处理和定量分析l 多重染色样品的观察多重染色样品的观察42020/11/30基本功能基本功能l多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像 采集采集光学显微镜分辨率：光学显微镜分辨率：共焦显微镜分辨率：共焦显微镜分辨率：52020/11/30基本功能基本功能l 定位、定量分析定位、定量分析62020/11/30基本功能基本功能l 无损伤、连续光学切片，显微无损伤、连续光学切片，显微“CT”l 三维重构成像三维重构成像 72020/11/30三维重构成像三维重构成像82020/11/30基本功能基本功能l 活体细胞荧光染色的动态观察及快速扫描成像活体细胞荧光染色的动态观察及快速扫描成像 92020/11/30102020/11/30LAS AF软件的基本界面软件的基本界面 112020/11/30在生物医学中的主要应用在生物医学中的主要应用（一）原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚（一）原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构细胞形态结构1.细胞原位检测核酸细胞原位检测核酸2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子原位检测蛋白质、抗体及其他分子3.检测细胞凋亡检测细胞凋亡4.细胞器观察及测定细胞器观察及测定5.观察细胞骨架观察细胞骨架6.检测细胞融合检测细胞融合7.检测细胞内脂肪检测细胞内脂肪（二）活体细胞或组织功能的实时动态监测（二）活体细胞或组织功能的实时动态监测1.细胞内离子动态变化的测量细胞内离子动态变化的测量2.膜电位的测量膜电位的测量3.细胞内细胞内PH值的测定值的测定4.检测细胞内活性氧物种的产生检测细胞内活性氧物种的产生5.检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位122020/11/30日常保养及注意事项日常保养及注意事项按照手册正确操作。如有疑问请及时联系按照手册正确操作。如有疑问请及时联系 Leica Leica 工程师，寻求专业帮助。工程师，寻求专业帮助。保证外部电源供应稳定。保证外部电源供应稳定。由于环境的变化会影响各部件的相对位等，无论由于环境的变化会影响各部件的相对位等，无论工作与否请保持室内恒温，清洁，干燥。室温工作与否请保持室内恒温，清洁，干燥。室温 22-25 22-25 摄氏度，相对湿度摄氏度，相对湿度80%80%以下为宜。以下为宜。使用一段时间后，精密器件可能会由于环境等因使用一段时间后，精密器件可能会由于环境等因数引起偏移，为保证仪器正常使用，请与数引起偏移，为保证仪器正常使用，请与 Leica Leica 的专业工程师联系，及时调较仪器。的专业工程师联系，及时调较仪器。使用显微镜油镜后请用无水乙醇清洁镜头前部。使用显微镜油镜后请用无水乙醇清洁镜头前部。132020/11/30日常保养及注意事项日常保养及注意事项短时间的停顿工作时，无需关闭系统。短时间的停顿工作时，无需关闭系统。只是做一些分析图片等工作时，无需打开激光器控只是做一些分析图片等工作时，无需打开激光器控制钥匙，以减少激光器的损耗。制钥匙，以减少激光器的损耗。请避免使用外界存储设备（请避免使用外界存储设备（U U盘，移动硬盘等），盘，移动硬盘等），以免电脑受病毒感染。以免电脑受病毒感染。请不要安装包含杀毒软件在内的任何未经软件生产请不要安装包含杀毒软件在内的任何未经软件生产商授权和经商授权和经LeicaLeica工程师认可的软件。工程师认可的软件。142020/11/30荧光探针的选择荧光探针的选择选择荧光探针的主要步骤：选择荧光探针的主要步骤：1 1、根据实验目的确定需要检测的目标；、根据实验目的确定需要检测的目标；2 2、确定可供选择的荧光探针的范围；、确定可供选择的荧光探针的范围；3 3、考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备、考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备 要求；要求；4 4、荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况。、荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况。152020/11/30样品要求样品要求样品经荧光标记样品经荧光标记组织切片在载玻片上，用盖玻片封片组织切片在载玻片上，用盖玻片封片固定的或活的贴壁培养细胞应培养在固定的或活的贴壁培养细胞应培养在共聚焦共聚焦专用专用小培养皿或盖玻片上小培养皿或盖玻片上悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片162020/11/30样品要求样品要求载玻片厚度应在载玻片厚度应在之间，盖玻片应光洁，厚度在之间，盖玻片应光洁，厚度在左右左右标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发尽量去除非特异性荧光信号尽量去除非特异性荧光信号封片剂多用甘油封片剂多用甘油：PBS混合液混合液（9：1)172020/11/30激光共聚焦适用的器皿及要求激光共聚焦适用的器皿及要求182020/11/30一、活细胞直接免疫荧光染色（溶酶体或钙离子）一、活细胞直接免疫荧光染色（溶酶体或钙离子）（1）将）将A549细胞细胞培养于细胞细胞培养于35 mm 激光共聚焦激光共聚焦 培养皿中间的圆形凹槽里；培养皿中间的圆形凹槽里；（2）染色前吸除培养皿的培养液，用）染色前吸除培养皿的培养液，用PBS洗洗2-3 次；次；（3）向培养皿中轻轻滴入）向培养皿中轻轻滴入Lyso-Tracker Red或或 Fluo-4/AM工作液工作液200L，使其覆盖凹槽里，使其覆盖凹槽里 全部细胞；全部细胞；（4）37、5%CO2 培养箱中孵育培养箱中孵育30 min；（5）吸除染液，用）吸除染液，用PBS洗洗2-3次；次；（6）再用）再用800L的的PBS覆盖凹槽里全部细胞，覆盖凹槽里全部细胞，用激光扫描共聚焦显微镜观察用激光扫描共聚焦显微镜观察Ca2+的变的变 化。化。192020/11/30二、间接免疫荧光染色（二、间接免疫荧光染色（FITCFITC标记）标记）（1）收集细胞）收集细胞 收集细胞爬片，吸取各培养孔上清，收集细胞爬片，吸取各培养孔上清，PBS冲洗（冲洗（5min3），），4%多聚甲醛固定多聚甲醛固定20min，晾干后用。，晾干后用。（2）通透及封闭）通透及封闭 取出细胞爬片，贴于载玻片上，用取出细胞爬片，贴于载玻片上，用PBS（5min3）冲洗后，加入冲洗后，加入0.3%Triton X-100穿透细胞膜穿透细胞膜5min，PBS（5min3），加入），加入2%BSA封闭抗原封闭抗原30min。（3）滴加一抗）滴加一抗 滴加用滴加用PBS稀释的一抗，湿盒内稀释的一抗，湿盒内4孵育过夜。每次孵育过夜。每次 实验均作空对照白（实验均作空对照白（PBS代替一抗）和同型对照（代替一抗）和同型对照（兔兔/鼠血清或鼠血清或IgG亚型代替一抗）。亚型代替一抗）。202020/11/30二、间接免疫荧光染色（二、间接免疫荧光染色（FITCFITC标记）标记）（4）滴加二抗）滴加二抗 次日用次日用PBS（5min3）冲洗后，滴加用）冲洗后，滴加用 PBS稀释的稀释的FITC标记的羊抗兔标记的羊抗兔/鼠二抗，鼠二抗，37孵育孵育60 min（避光）。（避光）。（5）染核并封片）染核并封片 用用PBS（5min3）冲洗后，滴加）冲洗后，滴加DAPI染染 核核5min,PBS冲洗（冲洗（5min3），滴加抗荧），滴加抗荧 光淬灭封片液。光淬灭封片液。（6）激光共聚焦显微镜拍照）激光共聚焦显微镜拍照212020/11/30Leica网上课程网上课程Leica Science Lab网址：网址：222020/11/30232020/11/30资料整理仅供参考,用药方面谨遵医嘱