基于糖酵解相关基因GFUS对三阴性乳腺癌疗效预测模型构建与验证.pdf

临床信息学第 37 卷第 1 期医学信息Vol.37 No.12024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.2024基金项目：蚌埠医学院自然科学重点项目（编号：2021byzd095）作者简介：章海斌（1991.4-），女，安徽蚌埠人，硕士研究生，住院医师，主要从事实体肿瘤的内科治疗研究基于糖酵解相关基因 GFUS 对三阴性乳腺癌疗效预测模型构建与验证章海斌1袁王 练2渊蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科1袁中医科2袁安徽 蚌埠233000冤摘要院目的基于生物信息数据库信息探讨糖酵解相关基因GDP-L-岩藻糖合酶渊GFUS冤对三阴性乳腺癌渊TNBC冤预后情况的预测价值遥方法从癌症基因组图谱渊TCGA冤数据库获取TNBC基因表达信息袁应用生物信息学方法分析GFUS在TNBC中的差异表达及预后差异袁筛选与GFUS共表达基因建立预测TNBC预后模型并验证遥结果从TCGA数据库下载160例TNBC组织和113例正常组织的基因转录组数据袁验证了GFUS在TNBC中的高表达与不良预后相关遥基于GFUS共表达基因袁通过COX回归分析得到3个与TNBC预后相关基因袁以此构建模型遥根据预后模型将外部数据集训练样本分为高风险组渊45例冤和低风险组渊62例冤遥 Kaplan-Meier生存分析显示袁高风险组总生存情况低于低风险组袁差异有统计学意义约0.05冤遥结论基于糖酵解相关基因GFUS建立的模型可有效预测TNBC预后情况袁并为个体化治疗提供新思路遥关键词院三阴性乳腺癌曰GDP-L-岩藻糖合酶曰预后模型中图分类号院R737.9文献标识码院ADOI院10.3969/j.issn.1006-1959.2024.01.004文章编号院1006-1959渊2024冤01-0022-08Construction and Validation of a Prediction Model for the Efficacy of Triple-negative Breast CancerBased on the Glycolysis-related Gene GFUSZHANG Hai-bin1,WANG Lian2(Department of Medical Oncology1,Department of Traditional Chinese Medicine2,the First Affiliated Hospitalof Bengbu Medical College,Bengbu 233000,Anhui,China)Abstract：Objective To explore the predictive value of glycolysis-related gene GDP-L-amylose synthase(GFUS)on the prognostic profile of triple-negative breast cancer(TNBC)based on bioinformatics database information.Methods The gene expression information of TNBC was obtained fromthe Cancer Genome Atlas(TCGA)database.The differential expression and prognostic differences of GFUS in TNBC were analyzed by bioinformaticsmethods.The co-expressed genes with GFUS were screened to establish a prognostic model for TNBC and verified.Results The gene transcriptomedata of 160 TNBC tissues and 113 normal tissues were downloaded from the TCGA database,which verified that the high expression of GFUS inTNBC was associated with poor prognosis.Based on GFUS co-expressed genes,three genes related to TNBC prognosis were obtained by COXregression analysis to construct the model.According to the prognostic model,the external data set training samples were divided into high-risk group(45 cases)and low-risk group(62 cases).Kaplan-Meier survival analysis showed that the total survival of the high-risk group was lower than that ofthe low-risk group,and the difference was statistically significant(0.05).Conclusion The model based on the glycolysis-related gene GFUS caneffectively predict the prognosis of TNBC and provide new ideas for individualized treatment.Key words：Triple-negative breast cancer;GDP-L-amylose synthase;Prognostic model三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一类特殊类型的乳腺癌，由于其缺乏雌激素和孕激素受体以及人表皮生长因子受体 2（Her-2）的表达，表现出不同组织学类型，基因组和免疫特征，因而被单列为一类疾病1。流行病学资料显示2，TNBC 的发生率占所有乳腺癌的 15%20%，好发于绝经前 40 岁以下的年轻女性。TNBC 具有高侵袭的特性，术后复发率高，约 25%，且术后复发时间仅为1940 个月，远低于非 TNBC 患者的 3567 个月。远处转移发生率约 46%，多累及脑及其他内脏器官，转移后的中位生存时间为 13.3 个月。因此其 5 年死亡率远高于其他类型乳腺癌，达 40%。复发后 TNBC患者发生 3 个月内概率高达 75%3。基于 TNBC 的异质性与难治性，建立有效的预后生物标志物对TNBC 患者准确预后和合理治疗策略至关重要。越来越多的证据表明，有氧糖酵解是癌细胞的重要代谢过程。不管是否有充足的氧气，肿瘤细胞主要利用糖酵解来产生能量，并且具有较高的糖酵解率。这种有氧糖酵解表型被称为 Warburg 效应4。Warburg 效应已在不同类型的实体肿瘤中得到证实，包括乳腺癌5。因此，靶向糖酵解过程可能成为 TNBC 的潜在窑临床信息学窑22临床信息学第 37 卷第 1 期医学信息Vol.37 No.12024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.2024治疗靶点。GFUS 又称组织特异性移植抗原 P35B，是一种 NADP(H)结合蛋白,催化 GDP-D-甘露糖代谢中的两步外聚酶和还原酶反应，将 GDP-4-酮-6-D-脱氧甘露糖转化为 GDP-L-岩藻糖，在糖基化过程中起着关键作用6。GFUS 表达的增加可以同时诱导核心岩藻糖蛋白和岩藻糖蛋白的升高。这种异常的岩藻糖基化在结直肠癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、食管癌等肿瘤中都普遍存在，其调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移、血管生成、转移、免疫逃逸等方面发挥作用7-9。研究发现10，GFUS 的高表达在乳腺癌的发生发展中起重要作用，可作为乳腺癌的独立分子标志物。因此，本研究通过应用多种生物信息学方法，实现 GFUS 共表达基因鉴定，构建了 TNBC 的预后模型，以期对指导 TNBC 个体化治疗提供新思路。1材料与方法1.1 资料来源 从 TCGA（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https:/portal.gdc.cancer.gov/）获取160 例 TNBC 肿瘤样本与 113 例癌旁正常组织样本的基因转录组数据及临床数据。1.2 方法1.2.1 GFUS 在 TNBC 中的表达差异及的功能分析使用 R 软件 v4.0.3 进行统计分析，对 GFUS 表达水平在癌与癌旁进行差异分析，约0.05 被认为差异有统计学意义。使用 c2.cp.kegg.v2022.1.Hs.symbols.gmt集合，采用基因富集分析（gene set enrichment anal原ysis，GSEA）分析 GFUS 高表达组和低表达组之间主要富集在的信号通路和表现的相应生物学功能。1.2.2 差异基因的筛选及共表达基因鉴定使用limma R 包对肿瘤和正常组织之间的 DEG 进行鉴定（FDR约0.05 and|log2FC|跃1），得到在 TNBC 中差异表达的基因。通过皮尔森相关性分析选择得到共表达基因（阈值相关性系数在 0.4 及 约0.05）。1.2.3 基因筛选与模型构建 对差异共表达基因的表达量以及生存数据进行单变量 Cox 比例风险回归分析，利用 R 包 survival coxph function，选择约0.05作为阈值得到预后显著基因。通过 Lasso 压缩估计构建模型：使用 R 软件包 glmnet 进行 lasso cox 回归分析，首先分析每个自变量的变化轨迹，随着 lamb原da 的逐渐增大而逐渐增加自变量系数趋于 0 的个数，后使用 5-fold 交叉验证进行模型构建，分析每个 lambda 下的置信区间，最终当 lambda=0.042 357 2时模型达到最优，最终模型公式如下：RiskScore4=0.5609*expGFUS+0.2356*expATP6V0B-0.1159*expGPLD1+0.1661*expMFSD31.2.4 预后模型验证 采用外部验证来评估该模型的预测价值，外部验证集和训练集具有相同的模型和系数。同样，每个样本的风险得分由样本的表达水平计算的而来。使用 R 软件包 timeROC 对 RiskScore进行预后分类的生存分析及受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析，分别分析 3、5 年的预后预测分类效率。1.3 统计学分析 R 软件（R 版本：4.0.3）进行所有数据统计分析。Wilcoxon 检验用于连续变量分析，2检验用于分类数据分析。Kaplan-Meier 分析和Log-rank 检验用于生存差异计算。分析结果均以约0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1 基于 TCGA 数据分析 GFUS 在 TNBC 中的表达差异 从 TCGA 数据库中获得的 mRNA 水平显示，癌旁正常组织中的 GFUS 水平低于癌组织（约0.05），见图 1。2.2 GFUS 在 TNBC 中的高表达与较差预后相关 与GFUS 低表达患者相比，GUFS 高表达患者具有更差的总生存率（overall survival，OS）（约0.05），见图2A。同样，高表达 GFUS 的 TNBC 患者具有更差的无进展生存期（progress free survival，PFS）、无病生存期（disease free survival，DFS）及疾病特异性生存期（disease free survival，DSS）（约0.05），见图 2B图2D。2.3 GFUS 高低表达组的功能分析 运用 GSEA 分析GFUS 高表达组和低表达组的基因主要富集的信号通路和生物学功能见图 3A3F。结果表明，高表达组 主 要 富 集 在 RENIN_ANGIOTENSIN_SYSTEM、图1 GFUS在TNBC中的癌与癌旁表达差异23临床信息学第 37 卷第 1 期医学信息Vol.37 No.12024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.2024GLUTATHIONE_METABOLISM、OXIDATIVE_PHOSPHORYLATION 等通路；低表达组主要富集在SMALL_CELL_LUNG_CANCER、WNT_SIGNALING_PATHWAY、TGF_BETA_SIGNALING_PATHWAY 等通路。2.4 疾病差异表达基因鉴定 为了进一步探索三阴性乳腺癌中差异表达的基因，使用 limma R 包对肿瘤和正常组织之间的 DEG 进行鉴定（FDR约0.05 and|log2FC|跃1），得到 3050 个基因，其中在肿瘤组织中上调基因共有 1099 个，下调基因有 1951 个，差异表达基因的火山图见图 4A，上下调前 100 个基因的表达热图间图 4B。注：A：OS 差异；B：PFS 差异；C：DFS 差异；D：DSS 差异图2 GFUS高低表达组生存指标差异ABCD图3基因集富集分析渊GSEA冤结果ABC24临床信息学第 37 卷第 1 期医学信息Vol.37 No.12024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.2024图3基因集富集分析渊GSEA冤结果渊续冤ABC2.5 GFUS 共表达基因鉴定 为了进一步鉴定 GFUS共表达基因，通过皮尔森相关性分析选择阈值相关性系数在 0.4 及约0.05，共得到 340 个共表达基因，其中正相关基因有 308 个，负相关基因有 32 个，相关性散点图见 5A，相关性基因的表达热图见 5B。2.6 模型构建 最终得到 77 个差异共表达基因图6A，对这 77 个基因的表达量以及生存数据进行单变量 Cox 比例风险回归模型。利用 R 包 survivalcoxph function，选择约0.05 作为阈值，最终得到了36 个预后显著的基因。应用 Lasso Least absoluteshrinkage and selection operator,Tibshirani（1996）方法进行压缩估计并构建模型，该算法可以进一步缩小基因范围，同时保证较高准确率。使用 R 软件包glmnet 进行 lasso cox 回归分析，首先对每一个自变量的变化轨迹进行分析，自变量系数趋于 0 的个数随着 lambda 的逐渐增大而增多，接着使用 5-fold 交叉验证构建模型，以分析每个 lambda 下的置信区间。图 6B、图 6C 可以看出当 lambda=0.042 357 2 时模型达到最优，最终模型公式如下：RiskScore4=0.5609*expGFUS+0.2356*expATP6V0B-0.1159*expGPLD1+0.1661*expMFSD3依据样本的表达水平分别计算了每个样本的风险得分，并绘制出样本的 RiskScore 分布。如图 7A所示，风险得分高的样本 OS 显著低于得分较低的，这提示了高的 RiskScore 样本预后更差。4 个不同的signature 基因随着风险值的增加表达情况发生变化，鉴定了 GPLD1 的高表达和低风险相关，为保护因素；鉴定了 GFUS、ATP6V0B、MFSD3 的高表达和高风险相关，为危险因素。根据 RiskScore 中值将样本划分高低风险组，并绘制 KM 曲线，如图 7B 所示，从中可以看出两组差异及其显著 Log-rank=0.004 59，=3.476（95%：1.4698.229），其中 80个注：A：火山图；B：热图图4差异表达火山图和热图AB25临床信息学第 37 卷第 1 期医学信息Vol.37 No.12024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.2024样本被划分为高风险组，80 个样本为低风险组；进一步使用 R 软件包 timeROC 对 CubScore 进行预后分类的 ROC 分析，分别分析了 1、3、5 年的预后预测分类效率，如图 7C 所示，从中可以看出模型具有很高的 AUC 线下面积，在 0.687 以上。2.7 外部数据验证 采用和训练集相同的模型和系数来实现外部验证，以评估该模型的预测价值。外部验证集中采用与训练集相同的模型和相同的系数。根据样本的表达水平来依次计算样本的风险得分，使用 R 软件包 timeROC 对 RiskScore 进行预后分类的 ROC 分析，对 3、5 年的预后预测分类效率进行了分别分析，如图 8C 所示，从中可以看出该模型具有很高的 AUC 曲线下面积，5 年的在 0.68 以上，接下来对 Riskscore 进行划分高低分线，并绘制KM 曲线，从中可以看出他们存在极显著的差异Log-rank=0.0446，=2.137（95%：1.018 4.483），其中高风险组的样本数为 45 个，低风险组的样本数为62个，见图 8A、图 8B。注：A：散点图；B：热图AB图5相关性基因的散点图和热图注：A：差异共表达基因；B：LASSO 变量筛选过程，每个 lambda 下的置信区间；C：每个自变量的变化轨迹，横轴代表自变量 lambda 的 log值，纵轴表示自变量的系数图6筛选构建模型的相关基因ABC26临床信息学第 37 卷第 1 期医学信息Vol.37 No.12024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.2024注：A：TCGA 数据中 risk score,生存时间与存活状态和 4-gene 的表达情况；B：4-gene signature 在 TCGA 数据集中的 KM 生存曲线分布；C：4-gene signature 分类的 ROC 曲线与 AUC图7预测风险模型的构建ABC注：A：GSE58812 数据中 risk score,生存时间与存活状态和 4-gene 的表达情况；B：4-gene signature 在外部数据集中的 KM 生存曲线分布；C：4-gene signature 分类的 ROC 曲线与 AUC图8外部数据集验证风险模型ABC27临床信息学第 37 卷第 1 期医学信息Vol.37 No.12024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.20243讨论三阴性乳腺癌是一种具有侵袭性的乳腺癌亚型，因缺少特异靶向药物，化疗仍是当前的主要治疗手段11。随着精准医学的发展，现已进入肿瘤管理的新时代。发现新的标志物对于提高 TNBC 的诊疗效果有着重大意义。癌细胞经历了新陈代谢的改变，以满足对能量、构建模块和氧化还原电位的巨大需求。肿瘤即使在有氧气的情况下也会表现出分泌葡萄糖和乳酸的行为，这一过程被称为有氧糖酵解12。糖酵解是癌细胞代谢的支柱，而癌细胞已经进化出各种机制来加强它。葡萄糖代谢与其他代谢途径交织在一起，使癌症代谢变得多样化和异质化，其中糖酵解发挥着核心作用13。致癌信号传导加速了糖酵解酶的代谢活动，主要是通过增强其表达或翻译后修饰。有氧糖酵解将葡萄糖发酵成乳酸，通过各种机制支持肿瘤的生长和转移14。最新研究也证实15，糖酵解与肿瘤治疗耐药相关。已知糖酵解中间产物的积累可激活磷酸戊糖途径产生 NADPH。NADPH 的产生使癌细胞能够维持足够水平的还原性谷胱甘肽（GSH）。GSH 是一种关键的非酶抗氧化剂，通过维持氧化还原状态以抵消化疗药物的作用，在保护癌细胞免受抗肿瘤药物的侵害方面发挥着关键作用16。同时，对糖酵解依赖性的增加是肿瘤代谢重编程的重要特征，这一过程参与了肿瘤微环境与肿瘤免疫调节17。因此，靶向糖酵解过程不仅可以抑制肿瘤生长、迁移和侵袭，同时，有望通过抑制糖酵解来提高抗肿瘤免疫治疗效果。与其他亚型相比，三阴性乳腺癌更加依赖糖酵解过程18。缺氧时 HIF-1琢 水平升高也与有氧糖酵解增加有关，与非 TNBC 细胞相比，HIF-1琢 稳定在TNBC 细胞中更常见。然而，HIF-1琢 的稳定并不局限于缺氧条件，在有氧条件下也能稳定，这足以驱动常氧条件下的糖酵解。有研究发现19，50%在常氧条件下表现出 HIF-1琢 稳定的癌细胞系是高度糖酵解和高侵袭性的。在常氧条件下 HIF-1琢 稳定背后的机制来自于乳酸和丙酮酸（有氧糖酵解的最终产物）通过刺激 HIF-1琢 的积累来调节缺氧诱导的基因表达，即使是在缺氧独立的条件下。Sadeghalvad M20等证实与 ER+肿瘤相比，TNBC 中的丙酮酸和乳酸显著增加；TNBC 与 ER+肿瘤相比，几乎所有糖酵解中间体都上调，这表明 TNBC 糖酵解过程增加。GFUS 作为参与糖酵解过程的关键基因，在多种肿瘤中高表达。本研究结果显示：GFUS 在 TNBC中的表达显著高于正常组织，且这种高表达与不良预后密切相关。基因富集分析结果显示：高 GFUS表达组多参与肿瘤代谢过程。基于对 GFUS 共表达基因筛选发现，GPLD1 的高表达和低风险相关，为保护因素；鉴定了 GFUS、ATP6V0B、MFSD3 的高表达和高风险相关，为危险因素。将筛选出的基因构建模型，根据该模型将 TNBC 患者分为高低风险组。生存分析显示出高风险组 OS 显著低于低风险组，提示 GFUS、ATP6V0B、MFSD3 与 TNBC 患者预后密切相关。风险评分可作为独立预后因素。另外，该模型可以有效预测不同风险组中乳腺癌患者 3、5年生存率。本研究尚有一定局限性，数据均来自TCGA 数据库，在其他数据库和临床样本中的验证需进一步进行。综上所述，基于 GFUS 构建的预后模型可以很高的评估 TNBC 患者预后，并可为 TNBC 靶向治疗药物发展及增强免疫治疗效果提供新思路。参考文献院1Yin L,Duan JJ,Bing XW,et al.Triple-negative breast cancermolecular subtyping and treatment progress J.Breast CancerRes,2020,22(1):61.2Lyons TG.Targeted Therapies for Triple-Negative BreastCancer J.Current Treatment Options in Oncology,2019,20(11):82.3Kizuka Y,Nakano M,Yamaguchi Y,et al.An Alkynyl-FucoseHalts Hepatoma Cell Migration and Invasion by InhibitingGDP-Fucose-Synthesizing Enzyme FX,TSTA3J.Cell Chem鄄ical Biology,2017,24(12):1467-1478.e5.4Paul S,Ghosh S,Kumar S.Tumor glycolysis,an essential sweettooth of tumor cells J.Seminars in Cancer 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