典型行业环境PCDDFs人体暴露评估技术研究-环保公益性行业科研项目实施方案.docx

环保公益性行业科研专项
项目实施方案

项目名称：典型行业环境PCDD/Fs 人体暴露评估技术研究
项目组织单位： 环境保护部
项目主持单位： 华中科技大学
项目协作单位：天津医科大学、中国环境科学研究院、湖北省预防医学科学院
项目负责人： 陈卫红
联系人： 汤乃军
电话： [phone]

二○一二年 四 月
项目实施方案（格式）
一、立项依据（项目研究意义、与国家科技规划纲要、环保行业科技计划等的关系、以及为环境管理工作提供的技术支撑）
多氯二苯并二恶英/呋喃(PCDD/Fs)作为普遍存在的环境污染物，种类达210种(其中PCDD有75种，PCDF有135种)，广泛于各种环境介质(水体、大气、土壤、沉积物、组织及生物体等)中，既属于持久性有机污染物(POPs)，同时也是重要的环境内分泌干扰物(EDCs)，性状稳定，熔点较高，极难溶于水，可以溶于大部分有机溶剂，极易在生物体内蓄积。为切实履行《斯德哥尔摩公约》中承诺的POPs削减计划，并完成《中国履行关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约国家实施计划》（简称《国家实施计划》）中的预期目标，2007年4月我国对PCDD/Fs等持久性有机污染物污染防治工作提出了明确要求，2010年10月19日环保部联合外交部、国家发改委、科技部、工信部、财政部、住房城乡建设部、商务部和国家质检总局九部委发布了《关于加强二恶英污染防治的指导意见》（简称《指导意见》），《指导意见》中指出我国17个主要行业PCDD/Fs排放企业有万余家，涉及钢铁、再生有色金属和废弃物焚烧等多个领域，并制定了PCDD/Fs污染防治的路线图和时间表，要在京津冀、长三角、珠三角等重点区域开展PCDD/Fs排放总量控制试点工作，并规划至2015年，我国应建立比较完善的PCDD/Fs污染防治体系和长效监管机制，重点行业PCDD/Fs排放强度需降低10%，基本控制目前呈现的PCDD/Fs排放增长趋势。
关于“持久性有机污染物的控制与对策研究”被明确列入《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》，作为环境领域优先主题。《国家环境保护“十二五”科技发展规划》中指出“持久性有机污染物对人体健康的影响及所导致的累积性健康风险”为环境科技发展趋势与需求，并将“我国典型区域持久性有机污染物(POPs)污染浓度、污染特征以及生态风险评价和预警技术”作为重点领域与主要任务。
伴随着工业化和城市化进程迅速推进，能源和原材料消耗不断增加，PCDD/Fs污染问题日益严重。在大气环境中近年来的研究表明，PCDD/Fs的污染水平仍处高位，给我国居民健康带来了巨大的安全隐患，我国PCDD/Fs污染防治面临严峻形势。下表中列出了部分国家和地区大气中PCDD/Fs的污染浓度。

表1部分国家和地区大气中PCDD/Fs的毒性当量浓度
采样点
时间
毒性当量I-TEQ(fg/m3)
参考文献
北京
2006年2月-12月
18-644(268)
[2]
广州
2004年7月-9月
56.7-1279.6
[3]
2005年6月-2006年5月
62-2190
[4]
台湾
1999年11月-2000年7月
56-348
[5]
2001年
63-150
[5]
Shanghai Jiading District
2008年
497.1
[6]
Shanghai Zhabei District,
289.0

Shanghai Pudong District
144.4

Shanghai Huangpu District
143.2

Hongkong
Jan.-Aug.2000
18-430
[7]
2001
46,55
[8]
2002
57,63

2003
66,71

2004
73,55

2005
82,71

2006
60,66

Korea
Jun.2000-Mar.2001
169-882
[9]
Japan
2002
66-840
[10]
2003
66-720

2004
83-550

Houston
Sep.2002-Apr.2003
40-55
[11]
Greece
Mar.-Oct.1999
40-119
[12]
Athens
Jul.2000
42.1
[13]
St.Paul
2000-2001
47-751
[14]
Manchester
Feb.1998
26-220
[15]
London
1991-1994
62-180
[16]

从上表资料结合已有的研究结果，可以发现中国内地各城市的PCDD/Fs毒性当量最高值已远超欧美国家，如广州最高值甚至达到2190 I-TEQ(fg/m3)，显示随着内地经济的高速发展，PCDD/Fs的排放也随之增多，同时缺乏相关控制措施导致了PCDD/Fs排放量剧增，而香港、日本等由于较早开始限制排放，PCDD/Fs排放已呈下降趋势；纵观发达国家地区的经验，我国PCDD/Fs排放控制亟待加强。吕亚辉[17]根据UNEP公布的《二恶英排放识别和定量工具包》对我国2004年PCDD/Fs的排放清单进行了估计，结果显示我国大陆地区向大气年排放PCDD/Fs约5kg，本地污染指数在和其他27个国家对比中最高，可见我国环境PCDD/Fs污染态势比较严重。
通常认为PCDD/Fs为人类非目的性副产物，自然界产生PCDD/Fs很少[18-22]。目前已查明的主要污染来源有：化工生产的杂质与副产物(多氯联苯、氯碱工业、五氯酚和染料工业等)，废物焚烧--生活垃圾、医疗废物和危险废物，纸浆氯漂白过程，金属熔炼与加工（钢铁生产和金属热处理），汽车尾气排放，稻杆焚烧等过程。PCDD/Fs类物质的主要排放行业涉及以下几个方面：
垃圾焚烧：自1977年荷兰阿姆斯特丹垃圾焚烧厂排放的烟气以及飞灰中检测到PCDD/Fs以来，虽然已经认识到垃圾焚烧排放PCDD/Fs的危害，但是由于焚烧方式处理垃圾能够最大化实现减容减重，而且具有处理量大、处理周期短等优点，故目前垃圾的焚烧法处理仍占较高比例。垃圾焚烧中PCDD/Fs的形成主要在以下3个过程中产生：(1) 作为燃料的原生垃圾中含有痕量的PCDD/Fs，在焚烧中未能完全破坏或分解，继续在固体残渣和烟气中存在；(2) 在燃烧炉膛中PCDD/Fs的生成(即高温气相反应)，生活垃圾中含有20-50%的有机物，此类有机物中还有聚氯乙烯氯苯、氯酚及其他有机氯，在垃圾焚烧过程中能够转化为PCDD/Fs；(3) 燃烧后的区域内PCDD/Fs的再生成(即低温异相催化反应，包括前驱物以及denovo合成反应)。我国浙江大学与清华大学[23-27]都已对垃圾焚烧过程中产生PCDD/Fs的排放规律进行了研究。除了生活垃圾外，医疗废弃物的焚烧过程[28-31]也将产生大量PCDD/Fs类排放物。
电子垃圾拆解：伴随着电子工业等高科技产业的迅猛发展，电子垃圾已经成为当今世界上增长速度最快的固体废弃物，目前每年正以4%的速度在增加，其对环境与健康的影响也越来越受到人们的关注。基于此，我国对于电子垃圾常采用先拆解进行简单分类后通过焚烧过程以去除PVC(聚氯乙烯)从而回收电子垃圾中的贵金属。在焚烧的高温过程中极易产生PCDD/Fs类物质[32-36]。李英明[34]等研究了浙江台州电子垃圾拆解地大气中PCDD/Fs的污染水平、分布特征和相分配规律并发现该地区ΣPCDD/Fs的浓度为2.91~50.6pg·m-3，毒性当量为0.20~3.45pg(I-TEQ)·m-3。
冶金行业：冶金行业是最重要的PCDD/Fs排放行业之一。冶金行业排放的PCDD/Fs主要集中在烧结工序，其次为电炉炼钢工序，其余的生产工序如炼焦、高炉炼铁、转炉炼钢、自备电厂等也有少量排放[37-43]。(1) 烧结过程的PCDD/Fs主要在烧结料层生成，其生成途径主要为从头合成。根据烧结烟气PCDD/Fs同族物质的分布情况分析，不论是质量浓度还是毒性当量均以多氯代二苯并呋喃(PCDFs)占主导地位(质量浓度占85%、毒性当量占89%)；在PCDFs中，又以2, 3, 7, 8-四氯PCDFs为主。(2) 作为电炉冶炼原料的废钢，一般都含有油脂、油漆涂料、塑料等有机物，废钢预热和装入电炉都将会有PCDD/Fs生成；排放废气中的PCDFs异构体较PCDDs多，且含4-6个氯原子的PCDFs和PCDDs占主导地位。(3) 根据PCDD/Fs的生成机理分析，高炉炼铁工序应有PCDD/Fs产生。(4) 球团焙烧、炼焦工序、转炉炼钢也应有PCDD/Fs生成。
化工行业：许多有机氯化学品，如PCBs、氯代苯醚类农药、苯氧乙酸类除草剂、五氯酚木材防腐剂、六氯苯和菌螨酚等，在生产过程中有可能形成PCDD/Fs类物质。
PCDD/Fs的工业排放控制受到世界各国的高度重视，其带来的公共卫生问题得到社会的极大关注。其中主要成分2, 3, 7, 8-四氯二苯并二噁英(TCDD)暴露可增加人群患癌症的危险度，1997年国际癌症研究机构(IARC)将TCDD确定为Ⅰ类人类致癌物。PCDD/Fs还是一种极强的致突变和致畸物质。部分美国越战退伍老兵因接触含PCDD/Fs的落叶剂，其子女脊柱裂、畸形等先天性缺陷病的发生率较高。PCDD/Fs具有神经毒性、生殖毒性、内分泌干扰毒性和免疫毒性。流行病学研究结果显示，孕妇接触PCDD/Fs容易导致早产、宫内发育迟缓和死胎的发生。AhR被认为是PCDD/Fs等多环芳香烃化合物进入体内发挥几乎所有毒性必需的转录因子。在没有配体的情况下，AhR是没有活性的，与热休克蛋白90(HSP90)二聚体、一分子亲免蛋白XAP2(又称AIP或ARA9)和一个p23分子构成四聚体存在于细胞浆中。当PCDD/Fs等配体通过被动扩散进入靶细胞后，与胞浆中的AhR结合并使之激活，导致AhR空间结构发生变化，核易位区、二聚化区以及DNA结合区域被暴露出来：随后配体受体复合物一起由细胞浆转移至细胞核内，在核内XAP2、p23和HSP90分别从复合体中解离出来，PCDD/Fs与AhR复合体与同家族另一成员芳香烃受体核转运蛋白(ARNT)聚合形成新的异源性二聚体AhR/ARNT，之后与DNA上特异的基因序列(被称为二恶英反应因子DRE)结合，从而激活下游一系列基因的转录和表达，PCDD/Fs正是通过调控这些基因的表达，才导致各种异常生物学效应的产生。
PCDD/Fs的暴露途径主要包括：呼吸吸入[46-50]、食物摄入[51-58]、皮肤暴露、土壤接触[59,60]等。1990年WHO工作组认定每日PCDD/Fs北京吸入量的90%来源于饮食的摄入。由于PCDD/Fs具有较好的脂溶性，故饮食来源的PCDD/Fs又主要来自于动物源性食物中，而植物源性食物中来源较少。土壤接触与皮肤摄入途径由于角质层的阻挡相对进入人体的有效剂量相对较低。总体而言，通过工业排放产生的PCDD/Fs，主要通过大气迁移途径由大气到达陆地和水生生态系统，在大气中以气态和颗粒态两种形式同时存在，并在气相和颗粒相之间达到分配平衡，通过干湿尘降进入陆生系统和水环境，最终通过食物链逐级富集，以高浓度方式进入生物体和人体，从而对生物和人类健康产生影响。所以空气中的二恶英是众多媒介中二恶英的主要来源。暴露的评估方法主要有2种：(1) 通过直接检测外暴露水平估算暴露量；(2) 通过检测内暴露标志物(如血脂中PCDD/Fs等)间接反应暴露量。通过第二种方法能够估计全暴露，由于不必采集与分析不同暴露途径的样本中的PCDD/Fs含量，故为较多研究者[61-69]所采用。
PCDD/Fs类物质内暴露的分析是典型的超痕量多组分定性定量分析，对特异性、选择性和灵敏度要求极高，被认为是当代化学分析领域的一大难点。PCDDs/PCDFs的分析技术研究20世纪70年代己经开始，分析设备从当初采用的带电子捕获检测器的气相色谱、填充柱/气相色谱/低分辨质谱、毛细管柱气相色谱/低分辨质谱发展到目前普遍采用的毛细管柱高分辨气相色谱/高分辨质谱，检测灵敏度也从当初的常量、微量发展到今天的痕量分析，目前普遍采用了分辨10000以上的高分辨质谱仪(HRMS)，并使用17种以上的同位素标记PCDD/Fs作为内标物质，可以对全部17种2, 3, 7, 8-位氯代异构体准确定量，大大提高了分析灵敏度和准确性，但同时也增加了分析难度和成本。
目前，对于该类物质的分析方法国际上基本以美国EAP1613方法为代表的同位素稀释/高分辨气相色谱/高分辨质谱法(ID/HRGC/HRMS)规定为PCDD/Fs类化合物的标准分析方法。该方法具有检测灵敏度高、选择性好、特异性强等优点，能从复杂的环境、食物样品基质中分离出各种异构体，并定性、定量分析出这些痕量乃至超痕量级的PCDD/Fs类化合物，对于正确评价PCDD/Fs的生态环境危险性具有重要作用。
开发简易、快速、低廉的分析方法和暴露监测技术是今后PCDD/Fs类化合物分析检测研究的方向，通过研究简易的取样方法和前处理方法、采用廉价的分析仪器、利用生物选择性的生物测试技术以及利用代替指标的分析方法等技术简化前处理步骤，缩短检测时间，降低检测成本。二嗯英生物测试法有EROD细胞培养法、萤光素酶方法、酶免疫方法(Enzyme Immuno Assay，EIA)和荧光免疫法(DELFIA)等 ，通过对从受体活化程度的测定来间接表达PCDDs/PCDFs类化合物的TEQ。
健康风险评估是桥连暴露水平与健康终点的纽带。EPA健康风险的估算方法主要有2大类，一类是针对致癌性污染物的致癌风险评估，另一类是针对非致癌污染物的非致癌风险评估，目前关于PCDD/Fs的健康风险研究主要立足于其致癌性上。为评价PCDD/Fs类物质的健康风险提出了PCDD/Fs毒性当量的概念，并通过毒性当量因子(Toxic Equivalent Factors, TEFs)来折算暴露浓度。设定毒性最强的2,3,7,8-TCDD的TEFs为1，其他PCDD/Fs类化合物依据其毒性强度折算成相对于2,3,7,8-TCDD的毒性当量，其权重为该化合物的TEF值。1988年北大西洋公约组织给出了其中具有明显毒性的17种PCDD/Fs物质的国际毒性当量因子(I-TEF, International toxic equivalent factors)[70]，通过对于最近的毒理学数据的汇总，2005年WHO更新了PCDD/Fs类物质的TEFs值，建立了新的I-TEF-WHO体系。
利用EPA提供的环境污染物致癌危险度评价模式，国外报道了一些有关PCDD/Fs的健康风险评估结果。Hwong-wen Ma[71]计算出在台湾几个点源附近人群多途径PCDD/Fs暴露的总致癌危险度为1.4×10-8-7.1×10-15，其中呼吸途径暴露的致癌危险度最高为1×10-6 。Wei-Yu Kao等[72]对台湾南方一个港口区域的17个PCDD/Fs排放点进行了危险度研究，发现该海港附近居民由多途径PCDD/Fs暴露导致的总致癌危险度为3.43×10-4 ，其中因呼吸暴露途径的致癌危险度为1.05×10-8 ～3.39×10-14 。同时发现不同点源附近人群总暴露风险也不同，烧结厂附近的居民获得的致癌危险度最高（3.36×10-4），而其中因呼吸暴露导致的致癌危险度为3.76×10-8。
本研究通过筛选PCDD/Fs暴露标志物体系，构建内暴露检测技术与方法，并在京津冀与长江流域中游地区选取典型行业与典型区域开展PCDD/Fs暴露水平与风险研究，为实现PCDD/Fs的污染控制并切实保护高污染行业/高暴露地区特定人群的健康提供技术支撑。
二、项目目标
2.1总体目标
建立PCDD/Fs人体内暴露监测方法，形成典型区域敏感人群体内的PCDD/Fs暴露评估技术，构建PCDD/Fs 的人体健康风险调查及评估技术。
2.2年度目标
第一年度：完成立项及方案审查，前期调研工作，完善与细化项目实施方案；完成相关资料收集与主要行业现场调查等工作；通过生物样品芯片检测、启动子甲基化改变分析、AhR/ARNT/DRE功能验证，完成内暴露标志物的筛选；并通过标准同位素稀释-高分辨气质联用(HRGC/HRMS)-多离子检测(MID)方法分析内暴露水平，进行暴露标志物与内暴露水平的关联性研究；在上述基础上，完成内暴露检测方法的建立与完善。
第二年度：基于PCDD/Fs人体内暴露监测分析方法与技术规范，选择典型区域敏感人群PCDD/Fs暴露组与对照组人群，并对所采集人体样品、大气和典型食品进行分析，完成典型区域敏感人群PCDD/Fs的暴露监测与评估，建立典型行业污染源PCDD/Fs排放对该区域敏感人群影响的数据库。
第三年度：基于上述PCDD/Fs人体内暴露水平的分析，进行内暴露标志物与健康风险的关联分析，建立人体暴露风险因子的模糊集合体系。完成项目结题和验收工作。

三、项目研究任务和技术路线（包括研究内容、研究方法、技术路线与关键技术）
3.1研究内容
3.1.1. PCDD/Fs的暴露标志物检测研究
3.1.1.1 基于典型行业人群的PCDD/Fs暴露生物样品芯片检测
将不同暴露梯度人群进行全基因组CHIP分析，基因表达谱分析严格按照美国Agilent技术公司提供的全人类基因表达Microarray系统书明书进行。应用I-llumina芯片进行全基因组扫描寻找差异基因。对结果进行相应的统计学分析，并对基因进行功能聚类分析，应用WebGestalt，DAVID和GSEA软件对基因进行功能富集分析。应用QRT-PCR对差异基因进行进一步验证。
3.1.1.2 基于典型行业人群的差异表达基因启动子甲基化改变检测
应用包含差异表达基因谱的甲基化芯片进行不同组别和代别甲基化状态改变的研究。采用甲基化DNA免疫沉淀方法（Methylated DNA Immunoprecipitation, MeDIP）合并NimbleGen DNA甲基化芯片进行基因谱甲基化改变的DNA测序，并进行不同暴露组人群之间的比较。
3.1.1.3 AhR，ARNT与DRE在PCDD/Fs暴露过程中功能分析
选择人正常肝细胞株，人正常乳腺上皮细胞株，人正常表皮细胞株，进行细胞培养和染毒，以AhR/ARNT，XRE基因操纵(质粒构造和转染细胞)的方法在人细胞水平探索分析二恶英暴露对人正常上皮细胞株的影响，研究细胞辅活化子的竞争性结合，受体与靶基因启动子区域募集反应机制，及下游瀑布基因表达的改变。
3.1.1.4 PCDD/Fs暴露标志物与内暴露水平的关联性研究
选取敏感人群，通过标准同位素稀释-高分辨气质联用(HRGC/HRMS)-多离子检测(MID)方法分析内暴露水平，进行暴露标志物与内暴露水平的关联性研究，对所选取内暴露标志物进行验证和分析。
3.1.2. PCDD/Fs人体内暴露监测方法的建立
3.1.2.1. 基于克隆表达的芳香烃受体系统的PCDD/Fs生物检测方法研究
采用分子生物学技术，依据芳香烃受体(AhR)在PCDD/Fs的活化作用下能与芳香烃受体核转位蛋白(ARNT)特异性结合的分子机制。旨在探索一种基于AhR系统的快速、简便、经济且特异性很强的PCDD/Fs生物检测方法。在此基础上，利用压电石英晶体原理和PCDD/Fs类化合物的毒性机理构建便携式的PCDD/Fs快速检测系统-压电生物传感器系统。
3.1.2.2. 基于细胞EROD酶活力的PCDD/Fs生物检测方法研究
采用细胞培养和分子生物学技术，依据PCDD/Fs类化合物对固着细胞EROD酶活力的特定的刺激作用原理，通过测定细胞EROD酶活力反映人体的PCDD/Fs危害水平。这种PCDD/Fs生物监测方法的研究为快速地测定环境和人体PCDD/Fs的浓度水平、进一步开展暴露评估研究提供基础依据。
3.1.2.3. 同位素稀释-高分辨气质联用方法优化研究
分别在PCDD/Fs环境标准参考物的研制、选择性吸附剂研究、生物样品PCDD/Fs高效提取技术和干扰物排除技术、PCDD/Fs多层次检测、POPs分析专用智能化软件等方面对该方法进行优化研究。
3.1.3 典型区域人群PCDD/Fs 的暴露水平调查与评估研究
3.1.3.1 典型区域敏感人群PCDD/Fs 的暴露水平检测
选取京津冀与长江中游地区典型行业(如垃圾焚烧厂、电子废弃物集中处置区、钢铁厂、氯化工企业厂等高风险暴露区)的作业者为研究对象，采集相应的作业环境样品（如排放源气体和作业区大气）和作业者的人体尿液、血液或孕妇乳汁；同时，根据各地的膳食结构特点和PCDD/Fs容易富集于高脂肪含量食品的特点，采集当地的食品样品。分析这些样品中PCDD/Fs的浓度水平和污染特征，确定典型行业/区域敏感人群的PCDD/Fs暴露水平。根据不同的摄入来源，为进一步分析典型行业/区域敏感人群的PCDD/Fs暴露途径提供数据支持。
3.1.3.2 典型区域敏感人群PCDD/Fs 的暴露评价
通过调查问卷获取被调查者居住地与焚烧炉的距离、居住年限、职业史、饮食习惯、身高和体重等暴露参数；根据样本人群居住地与污染源排放口如烟囱焚烧炉的距离、工厂规模焚烧炉的焚烧规模、烟气排放量、烟囱高度、平均风速和PCDD/Fs排放浓度等数据，利用扩散模型分别计算各暴露点的PCDD/Fs浓度，结合呼吸量和体力活动量初步估算人体吸入PCDD/Fs的剂暴露量，在不同距离远近布设点位采集和分析环境空气中PCDD/Fs的浓度，根据暴露参数调查结果，计算人群对PCDD/Fs的暴露剂量，验证实际暴露量与估算量的差异。
3.1.4 构建典型区域环境PCDD/Fs 健康风险调查及评估技术
基于已经构建的内暴露和外暴露PCDD/Fs的定量关系，利用已有PCDD/Fs毒性系数的有关资料评估PCDD/Fs暴露对人体健康的致癌风险；根据PCDD/Fs暴露评价的结果，结合人群暴露参数和毒理学数据，初步估算人群暴露PCDD/Fs的风险；运用模糊数学理论和层次分析理论，建立多个风险因子的参数模糊集合，根据专家评判法确定其权重，采用加权平均原则相结合，对PCDD/Fs的环境风险进行模糊评价，进一步构建内暴露PCDD/Fs的人群健康风险评价模型。
3.2研究方法
3.2.1. PCDD/Fs的暴露标志物检测研究
3.2.1.1. 基于典型行业人群的PCDD/Fs暴露生物样品芯片检测
(1) 研究人群的选择：
研究对象的选择见3.1.3.1，构成高、中、低暴露PCDD/Fs三组人群，各组为100人。针对调查对象，收集基本工作信息，采用统一调查表，调查人员询问被调查者，并由调查人员亲自填写调查表。调查内容包括人口学特征(年龄、身高、体重等)、疾病史和近期用药史、生活方式和个人嗜好(吸烟、饮酒等)、工作经历情况(工龄、工作变动、工种)。
(2) 人群生物样品收集：
分别收集高、中、低暴露人群外周静脉血样，提取血脂待分析检测。同时，采集相应的尿液。有条件的情况下，尽量采集当地哺乳期孕妇的母乳。
(3) 全基因组芯片检测：
将不同暴露梯度人群进行全基因组CHIP分析，基因表达谱分析严格按照美国 Agilent技术公司提供的全人类基因表达Microarray系统书明书进行。应用I-llumina芯片进行全基因组扫描寻找差异基因。对结果进行相应的统计学分析，并对基因进行功能聚类分析，应用WebGestalt，DAVID和GSEA软件对基因进行功能富集分析。应用QRT-PCR对差异基因进行进一步验证。
3.2.1.2. 基于典型行业人群的差异表达基因启动子甲基化改变检测
(1) 差异基因的选择：
通过基因芯片的检测和QRT-PCR的进一步验证，应用CpG islands searcher software确定目的基因CpG富集区域，应用Methprimer software设计引物。
(2) DNA的亚硫酸氢盐转化：
按照EpiTect Bisulfite Kit说明书进行，经亚硫酸氢钠处理后DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)变成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶则维持不变，因而经亚硫酸氢钠转换后甲基化和非甲基化的序列有所不同。
(3) PCR扩增：
将已修饰的DNA，分别用甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物进行PCR扩增，结果应用凝胶成像系统进行分析；比较不同代数仔鼠或同一代数内TCDD暴露组和对照组之间DNA甲基化的改变，从而确定类固醇激素基因网络中甲基化状态改变的基因。应用包含差异表达基因谱的甲基化芯片进行不同暴露组人群之间的比较。
3.2.1.3. AhR，ARNT与DRE在PCDD/Fs暴露过程中功能分析
(1) 质粒的构建：
人工合成AhR/ARNT，DRE基因序列，AhR/ARNT的全长互补DNA被植入pcDNA3载体，DRE被加入荧光素酶并植入pGL-3基本载体中，合成每条编码shRNA的DNA模板，并连接到载体相应的多克隆位点之间。
(2) 细胞转染稳定和荧光素酶实验：
选择人正常肝细胞株，人正常乳腺上皮细胞株，人正常表皮细胞株，进行细胞培养。在12-孔培养皿内使用脂质体对细胞进行指定质粒进行转染。作为标准化转染效率的参照质粒，25ngpRL-CMV质粒(Promega)在所有的实验中都共转染，为后续实验奠定基础。
(3) 几种细胞类型PCDD/Fs暴露：
依照PCDD/Fs的I-TEF值(国际毒性当量因子)，进行2,3,7,8-TCDD和2,3,4,7,8-PeCDF的细胞染毒，二者分别为PCDD与PCDF毒性当量因子最高者。

图1. PCDDs/PCDFs的I-TEF值
(4) PCDD/Fs暴露对细胞功能影响的标志物研究
使用流式细胞仪来分析细胞的生长状态。应用Transwell细胞趋化实验/细胞粘附实验检测细胞迁移和侵袭粘附能力。应用MTT法检测增殖能力的变化，应用平板克隆法检测细胞克隆形成能力的改变。
表示AhR活性的基因的表达：AhR，CYP1A1和CYP1B1
AhR下游通路与细胞生长有关的基因：BRCA1，TGF-β，p300，E2F
AhR下游通路与细胞凋亡相关的基因：Bax，TNF-α，c-myc
AhR下游通路与上皮间质转化(EMT )相关的基因：Wnt，CK2，NF-κB
检测上述基因的表达改变，DNA甲基化改变和组蛋白乙酰化改变。
3.2.1.4 暴露标志物与内暴露水平的关联性研究
选取部分敏感人群，通过标准同位素稀释-高分辨气质联用(HRGC/HRMS)-多离子检测(MID)方法分析内暴露水平，采用分子生物学方法对上述暴露标志物的表达进行检测，进行暴露标志物与内暴露TEQ水平的关联性进行研究，从而对所选取内暴露标志物进行验证和分析。

3.2.2. PCDD/Fs人体内暴露监测方法的建立
3.2.2.1. 基于克隆表达的芳香烃受体系统的PCDD/Fs生物检测方法研究
采用分子生物和生物化学技术，依据芳香烃受体(AhR)在PCDD/Fs的活化作用下能与芳香烃受体核转位蛋白(ARNT)特异性结合的分子机制。旨在探索一种基于芳香烃受体系统的快速、简便、经济且特异性很强的PCDD/Fs生物检测方法。在此基础上，利用压电石英晶体原理和PCDD/Fs类化合物的毒性机理、免疫反应原理相结合，以及对常规的ELISA方法进行改进构建便携式的PCDD/Fs快速检测系统-压电生物传感器系统。
(1)以小鼠肝组织中提取的总RNA为模板，扩增目的基因，DNA测序分析验证后，构建AhR和ARNT全长及相应片段AhR-PAS、AhR-C和ARNT-PAS共5个蛋白的重组表达质粒。酶切鉴定后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，在该原核系统中大量表达目的蛋白质，采用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化GST-融合蛋白或利用凝血因子Xa对融合蛋白的进行酶切获得目的蛋白质。
(2)利用AhR-PAS和AhR-C这两个特异性片段蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。
(3)从C57BU6)纯系小鼠肝组织中提取具有结合活性的天然AhR，采用Bradford法对总蛋白进行定量，计算出其中AhR的含量。
(4)将天然AhR与GST-ARNT、GST-ARNT-RAS以等摩尔的比例混合，在室温下与不同剂量的TCDD进行温育结合。将结合了的GST-ARNT-AhR复合物用磁珠进行亲和吸附，并用结合缓冲液洗去非特异性结合蛋白。最后采用免疫印迹方法，以AhR-PAS和AhR-C两种蛋白制得的多克隆抗体作为检测所需的一抗，研究AhR与融合蛋白ARNI，ARNT-PAS结合的条件、程度及剂量反应关系，从而对TCDD进行定量分析。
3.2.2.2. 基于细胞EROD酶活力的PCDD/Fs生物检测方法研究
采用细胞培养和分子生物学技术，依据PCDD/Fs类化合物对固着细胞EROD酶活力的特定的刺激作用原理，通过测定细胞EROD酶活力反映人体的PCDD/Fs危害水平。这种PCDD/Fs生物监测方法的研究为快速地测定环境和人体PCDD/Fs的浓度水平、进一步开展暴露评估研究提供基础依据。
3.2.2.3. 同位素稀释-高分辨气质联用方法优化研究
分别在PCDD/Fs环境标准参考物的研制、选择性吸附剂研究、生物样品PCDD/Fs高效提取技术和干扰物排除技术、PCDD/Fs多层次检测、POPs分析专用智能化软件等方面对该方法进行优化研究。
(1) PCDD/Fs环境标准参考物的研制：
采用震荡喷淋添加技术，取若干等分并利用同位素稀释-气相色谱/高分辨磁质谱（Isotope- HRGC/HRMS）进行精确定量分析，并按照国家有关环境标准参考物研制的标准程序，对以上基质样品作为POPs环境分析标准样进行考察和认证。
(2) 选择性吸附剂研究：
采取表面分子印迹、溶胶-凝胶免疫亲合技术研制或特殊分子筛等材料，研发高效、特异性强的纯化分离柱填料，提高PCDD/Fs与其它干扰物质（如多氯联苯和多溴联苯醚等）分离纯化的效率。
(3) 高效提取技术：
针对PCDD/Fs、多氯联苯分析研制高效、快速样品提取技术，建立广泛适用的样品提取方法。结合PCDD/Fs、多氯联苯选择性吸附剂研究，研制PCDD/Fs、多氯联苯样品高效、廉价、易操作的提取、净化联用设备。
(4) POPs分析专用智能化软件：
根据溶质在色谱柱内的迁移模型，结合色谱保留规律、峰形参数（峰高，峰宽，峰面积，峰不对称度）和质谱资料，建立自动峰识别和目标优化方法。采用指数修正的高斯模型对色谱峰进行拟合，以Leverberg Marquardt法对重叠色谱峰进行自动解析，研制精确的定量分析模块。同时，开发方便的样品信息管理、自动分析报告生成、分析数据质量控制的数据管理模块。
(5) PCDD/Fs类污染物多层次检测方法：
利用生物诊断技术、气相色谱/电子捕获检测器（GC/ECD）、气相色谱/低分辨气谱（GC/LRMS）和气相色谱/高分辨质谱（GC/HRMS），探索适合中国国情的PCDD/Fs多层次检测的规范方法；另外，从样品制备到检测技术方面探索多溴二苯醚等《斯德哥尔摩公约》之外的持久性有机污染物的分析方法。
3.2.3. 典型行业/区域人群PCDD/Fs 的暴露水平调查与评估研究
(1) 暴露水平调查：
选取北方(京津冀)与南方(长江中游地区)4个典型行业：垃圾焚烧业、电子废弃物处置业、钢铁铸造业、氯化工行业为对象进行研究。每个行业依据生产环境PCDD/Fs水平选择高暴露与低暴露工人各50名为研究对象，在4个典型行业周围5公里范围内各选择50名成年居民(年龄、性别分布同工人)，分析典型行业PCDD/Fs周围区域人群的PCDD/Fs暴露。选择远离典型行业(20公里以上)的乡村为对照，对照人群50名(年龄、性别分布同工人)。合计评价1300人的内暴露水平。

表1. PCDD/Fs暴露水平调查设计
研究对象
高暴露组
低暴露组
区域居民
对照组
垃圾焚烧
100
100
100
100
钢铁铸造
100
100
100
电子废弃物处置
100
100
100
氯化工
100
100
100

(2) 典型区域及其人群的暴露水平调查：
典型区域生产环境及其排放PCDD/Fs的调查与测定，收集企业基本情况，主要工艺流程，开始生产年份、主要产品及产量等基本信息。进行不同工作岗位环境空气和排放气中PCDD/Fs的采样和测定，区分环境空气PCDD/Fs高、低暴露区。在不同距离远近布设点位采集和分析环境空气中PCDD/Fs的浓度，对研究的居民对象集中区域进行环境空气PCDD/Fs的测定。
选择的研究对象，通过调查问卷获取被工作岗位及工作史（起止工作时间）信息，居民询问居住地、居住年限、职业史；所有研究对象均收集个人基本情况、饮食习惯、吸烟饮酒、既往家族及个人疾病史等信息，并测量身高和体重等参数；根据工作环境PCDD/Fs水平，和居民居住地与PCDD/Fs排放源距离和居住环境PCDD/Fs水平等，利用扩散模型分别计算各暴露点的PCDD/Fs浓度，初步估算人体吸入PCDD/Fs的暴露量，根据暴露参数调查结果，计算人群对PCDD/Fs的暴露剂量，同时，根据各地的膳食结构特点和PCDD/Fs容易富集于高脂肪含量食品的特点，分析当地的食品样品PCDD/Fs含量。人群PCDD/Fs水平为环境空气和食品摄入PCDD/Fs量的合计值。
(3) 研究典型行业/区域人群内暴露的测定：
研究对象采集尿液、血液，有条件的采集孕妇乳汁；应用上述（3.2.2）建立的测定方法进行人群PCDD/Fs内暴露量测定，验证实际暴露量与估算量的差异。
3.2.4. 构建行业/典型区域环境PCDD/Fs 健康风险调查及评估技术
分别考虑达标排放和事故排放两种情况下通过空气传播途径引起的人体暴露剂量，进而通过风险表征得出个人致癌风险的相对大小；分析内暴露样品中PCDD/Fs的含量，构建内暴露和外暴露PCDD/Fs的定量关系；利用已有PCDD/Fs毒性系数的有关资料评估PCDD/Fs暴露对人体健康的致癌风险；根据PCDD/Fs暴露评价的结果，结合人口统计学、人群暴露参数等数据和毒理学数据，初步估算人群暴露PCDD/Fs的风险；根据内暴露和外暴露PCDD/Fs的定量关系，利用外暴露PCDD/Fs的毒性资料，运用模糊数学理论和层次分析理论，建立多个风险因子的因子集、评价集、隶属函数和权重集等模糊集合，根据专家评判法确定其权重，采用加权平均原则相结合，对PCDD/Fs的环境风险进行模糊评价，进一步构建内暴露PCDD/Fs的健康风险评价模型。
3.3技术路线

33

3.4拟解决的关键技术
3.4.1. PCDD/Fs暴露标志物体系建立：参照同位素稀释-气相色谱/高分辨磁质谱分析所测试得到的人群内暴露TEQ水平，通过全基因组芯片、甲基化检测和AhR/ARNT/DRE功能分析等手段，综合比较筛选，从而确定PCDD/Fs暴露标志物体系建立。
3.4.2. 典型行业/区域敏感人群PCDD/Fs 的暴露水平调查：根据人体不同的摄入，结合人群的总膳食结构特点，分析人体样品和其它样品中PCDD/Fs的浓度水平和污染特征，确定人体PCDD/Fs内暴露水平和暴露途径。
3.5创新点
3.5.1 对PCDD/Fs的高暴露人群进行内暴露生物标志物研究。
3.5.2 确定不同人群的PCDD/Fs暴露水平和暴露途径。
3.5.