人可溶性基因的克隆及其在毕氏甲醇酵母中的表达、纯化及鉴定研究课件.ppt

文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。内容凋亡与肿瘤的关系TRAIL的发现TRAIL的选择性作用机制TRAIL的高效分泌表达结束文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。凋亡与肿瘤的关系文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。凋亡系细胞的自杀过程不会引起炎症反应和组织损伤不会引起炎症反应和组织损伤对发育和自稳至关重要对发育和自稳至关重要使机体各组织维持一定的细胞数并消除使机体各组织维持一定的细胞数并消除个别威胁生物生存的细胞个别威胁生物生存的细胞细胞在严重细胞在严重DNA损伤后，凋亡启动失败损伤后，凋亡启动失败会导致恶性肿瘤的发生会导致恶性肿瘤的发生文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。世界“抗癌”形式严峻，全世界每年有1000万新发癌症病人，人们对抗癌新药的需求非常迫切，近年来蛋白类药物应用于临床取得了不错的效果，这种情况激励着人们利用基因工程手段不断地去寻找抗癌新药。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。TRAIL的发现文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。19951995年，年，WileyWiley等首次发现并克隆成功等首次发现并克隆成功一种广泛分布于机体各组织的一种广泛分布于机体各组织的型单跨型单跨膜糖蛋白，膜糖蛋白，N N末端位于胞内，末端位于胞内，C C末端位于末端位于胞外胞外基因定位于基因定位于3 3号染色体长臂号染色体长臂2 2区区6 6带带（3q263q26），编码），编码281281个氨基酸个氨基酸属于属于TNFTNF家族，主要以三聚体发挥作用，家族，主要以三聚体发挥作用，可诱导多种肿瘤细胞的凋亡可诱导多种肿瘤细胞的凋亡文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。被命名为被命名为TRAILTRAIL Tumor necrosis factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand 即：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，又即：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，又称凋亡素称凋亡素-2配体（配体（Apoptosis receptOr-2 Ligand APO2L）文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。人们发现TRAIL114281的胞外部分，即可溶性APO2L/TRAIL与胞膜结合的全长TRAIL具有相同强度的诱导肿瘤细胞凋亡的作用，而且其又便于表达、纯化和复性，于是我们可以通过基因工程技术获得人TRAIL胞外114281肽段部分，从而TRAIL有望成为一种全新的抗肿瘤药文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。与其他抗肿瘤药以及放疗相比，TRAIL所具有的优点：抗癌作用不依赖于抑癌基因抗癌作用不依赖于抑癌基因p53抗瘤谱广抗瘤谱广杀伤作用强杀伤作用强协同作用显著协同作用显著正常组织对其诱导的凋亡作用并不敏感，正常组织对其诱导的凋亡作用并不敏感，安全系数高安全系数高文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。114281N端C端Apo-2L细胞膜Apo-2L的结构的结构95281文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。三个三个TRAILTRAIL单体分别通过自身位于单体分别通过自身位于CysCys230的一个巯基，的一个巯基，与一个与一个ZnZn离子螯合成一个三聚体发挥作用离子螯合成一个三聚体发挥作用文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。TRAIL的选择性作用机制文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。目前已确认TRAIL有五种不同受体：两种死亡受体：两种死亡受体：DR4和DR5两种诱骗受体：两种诱骗受体：DcR1和DcR2一种可溶性受体：一种可溶性受体：OPG文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。TRAIL诱导凋亡的作用机制DR4和和DR5具有与具有与TNF受体超家族其它成员类似受体超家族其它成员类似的胞浆死亡区，与的胞浆死亡区，与TRAIL特异性结合并活化后，特异性结合并活化后，其胞内死亡结构域相互聚集，并进一步通过同嗜其胞内死亡结构域相互聚集，并进一步通过同嗜作用募集结合器蛋白，结合器蛋白接到死亡受体作用募集结合器蛋白，结合器蛋白接到死亡受体传来的凋亡信号后，将引起胞内传来的凋亡信号后，将引起胞内caspase前体即前体即Procaspase在其末端募集并串联结合，从而形成在其末端募集并串联结合，从而形成“TRAIL-DR4、DR5-接头蛋白接头蛋白-procaspase”大分大分子子复合体，即凋亡酶体复合体，即凋亡酶体（apoptosome）。凋亡酶体凋亡酶体形成后，其分子中的形成后，其分子中的procaspase通过自身水解而通过自身水解而文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。成为有活性的成为有活性的caspase，并进一步激活并进一步激活caspase级联级联反应，反应，caspase的蛋白酶解级联反应能够不断传递的蛋白酶解级联反应能够不断传递和放大凋亡信号，从而引发对和放大凋亡信号，从而引发对TRAIL敏感的细胞敏感的细胞发生大量、快速的凋亡反应。发生大量、快速的凋亡反应。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。TRAIL的选择性作用机制DcR1DcR1和和DcR2DcR2的胞外区均有两个与的胞外区均有两个与DR4DR4、DR5DR5高度同高度同源的富含半胱氨酸的重复序列能够与源的富含半胱氨酸的重复序列能够与TRAILTRAIL结合，结合，但但DcR1DcR1无胞内区；无胞内区；DcR2DcR2的胞内死亡区不完整，呈的胞内死亡区不完整，呈无功能的截断状态。因此，无功能的截断状态。因此，DcR1DcR1和和DcR2DcR2与与TRAILTRAIL结合后都不能传导凋亡信号，故被称作诱骗受体结合后都不能传导凋亡信号，故被称作诱骗受体，其在正常组织中有广泛的表达，而在肿瘤细胞，其在正常组织中有广泛的表达，而在肿瘤细胞系或新鲜分离的肿瘤组织中却未见表达。因此，系或新鲜分离的肿瘤组织中却未见表达。因此，正常细胞由于有诱骗受体与正常细胞由于有诱骗受体与DR4DR4和和DR5DR5竞争结合竞争结合TRAILTRAIL而可逃逸而可逃逸TRAILTRAIL的杀伤，而肿瘤组织则由于的杀伤，而肿瘤组织则由于缺乏诱骗受体的保护而易被缺乏诱骗受体的保护而易被TRAILTRAIL杀伤杀伤 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文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。甲醇酵母系统在蛋白表达方面具有其它表达系统所不可比拟的优点：是一种真核表达系统，可对所表达蛋白进是一种真核表达系统，可对所表达蛋白进行加工、折叠和翻译后修饰，尤其对于真行加工、折叠和翻译后修饰，尤其对于真核蛋白而言，其可较好地保持所表达蛋白核蛋白而言，其可较好地保持所表达蛋白的生物活性的生物活性极高的表达量，且表达水平可用甲醇进行极高的表达量，且表达水平可用甲醇进行调节，许多蛋白的表达水平已达调节，许多蛋白的表达水平已达g/lg/l级水级水平，超过了昆虫细胞、哺乳动物细胞，甚平，超过了昆虫细胞、哺乳动物细胞，甚至大肠杆菌表达系统，破伤风毒素片段至大肠杆菌表达系统，破伤风毒素片段C C的表达水平甚至高达的表达水平甚至高达1212g/lg/l 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。适合于高密度培养，可进行大规模发酵以适合于高密度培养，可进行大规模发酵以生产外源重组蛋白生产外源重组蛋白无需昂贵的设备及原材料，生产成本较昆无需昂贵的设备及原材料，生产成本较昆虫和哺乳动物表达系统要低得多虫和哺乳动物表达系统要低得多可进行胞外分泌表达，且培养介质中的杂可进行胞外分泌表达，且培养介质中的杂蛋白较少，表达产物容易纯化，纯化过程蛋白较少，表达产物容易纯化，纯化过程中目的产物的活性不会受到什么损失中目的产物的活性不会受到什么损失 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。本人旨在构建一个TRAIL的高效、稳定的生物来源系统，故选择pPIC9/pPIC9K表达载体克隆可溶性TRAIL基因，并在毕氏甲醇酵母(Pichia pastoris)中对其进行高效分泌表达 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。技术路线技术路线用用RT-PCRRT-PCR方法扩增出人可溶性方法扩增出人可溶性APO2L/TRAILAPO2L/TRAIL的的cDNAcDNA序列，将其插入到毕氏甲醇酵母序列，将其插入到毕氏甲醇酵母(Pichia pastorisPichia pastoris)表达载体表达载体穿梭质粒穿梭质粒pPIC9/pPIC9KpPIC9/pPIC9K的的MFMF信号肽基因后，位于信号肽基因后，位于醇氧化脱氢酶醇氧化脱氢酶(AOX)(AOX)启动子下游，得到启动子下游，得到重组质粒重组质粒pPIC9-TRAIL114281pPIC9-TRAIL114281，并将其转，并将其转化到甲醇酵母宿主菌化到甲醇酵母宿主菌GS115GS115，再经筛选得到，再经筛选得到 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。可溶性可溶性TRAIL的高表达菌株，菌株在甲醇的高表达菌株，菌株在甲醇梯度诱导下，高水平表达可溶性梯度诱导下，高水平表达可溶性TRAIL。最后纯化并测定表达产物的氨基酸序列和最后纯化并测定表达产物的氨基酸序列和生物学功能生物学功能 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。TRAIL的分泌表达及可能遇到的障碍文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。重组菌株在甲醇梯度诱导下，胞内可高水平表达MF-TRAIL114281，MF信号肽可使可溶性TRAIL前体从内质网输送至高尔基体，经KEX2切割除去MF信号肽，从而使可溶性TRAIL分泌至胞外实现其分泌表达 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。MF 信号肽信号肽TRAIL114281TRAIL114281KEX2 cleavage siteKEX2 cleavage site-GluGlu-AlaAla-gene gene seqseq of TRAIL of TRAIL114281114281MF leader leader seqseq-GAGGCT-.文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。MF信号肽与信号肽与TRAIL114281之间存在之间存在“-Glu-Ala-”（谷丙对）有利于（谷丙对）有利于MF信号肽的信号肽的切割，且这种谷丙对串联得越长，切割，且这种谷丙对串联得越长，MF被被切除的几率越大，即在设计重组穿梭质粒切除的几率越大，即在设计重组穿梭质粒时，时，MF信号肽基因序列与目的基因序列信号肽基因序列与目的基因序列之间所加的之间所加的“-GAGGCT-”串联对越长，目串联对越长，目的产物分泌表达的几率越大。的产物分泌表达的几率越大。MF信号肽信号肽被切除后，目的产物前端的谷丙对也会被被切除后，目的产物前端的谷丙对也会被某种酶切除，但通常由于该二肽切割得不某种酶切除，但通常由于该二肽切割得不完全，从而导致目的产物氨基酸组成不均完全，从而导致目的产物氨基酸组成不均一一 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。也有实验报道：目的产物的第一个氨基酸如果空间位阻比较小，也有利于信号肽的切除 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。考虑到该表达系统目的产物的药用前景，故考虑到该表达系统目的产物的药用前景，故在技术路线设计上，本人首先选择了在技术路线设计上，本人首先选择了MFMF信信号肽基因与目的基因间不加号肽基因与目的基因间不加“-GAGGCT-”“-GAGGCT-”的的重组穿梭质粒，但这可能会导致目的产物不重组穿梭质粒，但这可能会导致目的产物不分泌表达的严重后果，针对这种情况，本人分泌表达的严重后果，针对这种情况，本人同时又分别设计了含有一个和含有两个同时又分别设计了含有一个和含有两个“-“-GAGGCT-”GAGGCT-”串的两种重组质粒。一旦第一种串的两种重组质粒。一旦第一种选择失败，马上启用后两种重组穿梭质粒进选择失败，马上启用后两种重组穿梭质粒进行发酵表达，同时跟踪检测相应产物的氨基行发酵表达，同时跟踪检测相应产物的氨基酸组成及生物学活性酸组成及生物学活性 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。