黄连素通过重塑肠道菌群和调节PI3K_AKT信号通路改善多囊卵巢综合征小鼠的作用机制研究.pdf
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1、352.疑难病杂志2 0 2 4年3月第2 3卷第3期Chin J Diffic and Compl Cas,March2024,Vol.23,No.3D01】10.396 9/j.i s s n.16 7 1-6 450.2 0 2 4.0 3.0 18黄连素通过重塑肠道菌群和调节PI3K/AKT信号通路改善多囊卵巢综合征小鼠的作用机制研究论著基础杨宇琦,吴丽娜,孙克,邢伟园,侯越,张丽文基金项目:上海市卫生健康委员会科研课题(2 0 2 0 4Y0392);上海市闵行区自然科学研究课题(2 0 2 3MHZ040)作者单位:2 0 110 0 上海,复旦大学附属上海市第五人民医院妇产科通信
2、作者:张丽文,E-mail:18 918 17 7 8 19 16 3.c o m【摘要】目的探究黄连素(BBR)对多囊卵巢综合征(PCOS)小鼠肠道菌群的调节作用及其治疗机制。方法于2 0 2 1年6 月一2 0 2 2 年6 月在复且大学附属上海市第五人民医院实验动物中心进行实验。清洁级健康雌性C57BL/6J小鼠2 4只,随机选取6 只作为正常对照组,其余18 只应用来曲唑灌胃制备PCOS模型。造模成功后,将造模小鼠随机分为模型(PCOS)组、阳性药达英-35(0.2 mgkg-1d-)组和BBR(100kg-.d-)组,每组6 只,给予相应药物治疗14d。收集小鼠结肠内粪便,采用16
3、S rDNA测序检测肠道菌群;称小鼠体质量,观察小鼠阴道脱落细胞形态学改变;检测血清性激素和胰岛素水平;HE染色观察卵巢病理结构;免疫组化检测小鼠结肠Claudin-1、O c c lu d in表达;Westerm-blot检测卵巢组织PI3K/AKT通路相关蛋白表达。结果16 SrDNA测序结果显示,PCOS组肠道菌群多样性较正常对照组发生变化。在属水平,与正常对照组比较,PCOS组布劳特氏菌属、韦永氏球菌属、李生球菌属和梭形杆菌属等有害菌属丰度增加;BBR治疗后小鼠肠道菌群紊乱状态得到改善,乳酸菌属等有益菌属丰度增加。与正常对照组比较,PCOS组小鼠雌二醇(E,)、卵泡刺激素(FSH)和
4、胰岛素敏感系数(ISI)水平降低(t/P=2.847/0.017,3.079/0.012,3.541/0.005),体质量和睾酮(T)、黄体生成素(LH)、L H/FSH、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(H0MA-IR)水平升高(t/P=4.782/0.013,4.626/0.001,5.703/0.001,2.578/0.028,4.156/0.002,3.255/0.009,7.439/0.001),动情周期紊乱,光镜下卵巢结构符合PCOS病理特征,Claudin-1、O c c l u d i n、p-PI 3K/PI 3K和p-AKT/AKT表达下降(t/P
5、=3.806/0.003,3.795/0.004,13.474/0.001,17.285/0.001)。与PC0S组比较,达英-35组E,、FSH 和ISI水平升高(t/P=2.389/0.038,3.354/0.007,3.198/0.010),体质量和T、L H、L H/FSH、FI NS、HOMA-IR水平降低(t/P=3.133/0.011,3.416/0.007,4.596/0.001,2.327/0.042,2.908/0.016,6.096/0.001),动情周期和卵巢结构得到改善Claudin-1、O c c l u d i n、p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT表达
6、升高(t/P=2.390/0.038,2.247/0.048,7.323/0.001,7.564/0.001);BBR组ISI水平升高(t/P=3.198/0.010),体质量和T、L H、L H/FSH、FPG、FINS、H0MA-IR水平明显降低(t/P=3.668/0.004,4.602/0.001,6.101/0.001,2.535/0.030,5.950/0.001,2.914/0.015,7.630/0.001),动情周期和卵巢结构得到改善,Claudin-1、O c c l u d i n、p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT表达升高(t/P=3.799/0.003,3.
7、185/0.010,7.47 3/0.0 0 1,8.18 7/0.0 0 1)。结论来曲唑诱导的PC0S小鼠存在菌群失调,BBR通过调节肠道菌群分布可能有助于激活PI3K/AKT通路,改善肠道屏障功能,达到治疗PCOS的目的。【关键词】多囊卵巢综合征;黄连素;肠道菌群;PI3K/AKT信号通路;小鼠【中图分类号】R711.75Mechanism of action of flavopiridol to improve polycystic ovary syndrome by remodeling intestinal flora and regula-ting PI3K/AKT signal
8、ing pathway Yang Yuqi,Wu Lina,Sun Ke,Xing Weiyuan,Hou Yue,Zhang Liwen.Department ofObstetrics and Gynecology,Shanghai Fifth Peoples Hospital,Fudan University,Shanghai 201100,ChinaFunding program:Scientific Research Project of Shanghai Municipal Health and Wellness Commssion(20204Y0392);NaturalScienc
9、e Research Project of Minhang District,Shanghai(2023MHZ040)Corresponding author:Zhang Liwen,E-mail:18918177819 Abstract Objective To investigate the regulatory effect of BBR on the intestinal flora of mice with polycystic o-vary syndrome(PCOS)and its therapeutic mechanism.Methods In June 2021-June 2
10、022,experiments were carried out inthe Experimental Animal Center of Shanghai Fith Peoples Hospital Affiliated to Fudan University,24 clean-grade healthy fe-【文献标识码】A疑难病杂志 2 0 2 4年3月第2 3卷第3期Chin J Dific and Compl Cas,March 2024,Vol.23,No.3male C57BL/6J mice,6 mice were randomly selected as the normal
11、 control group,and the remaining 18 mice were used toprepare the PCOS model by letrozole gavage.After successful modeling,the modeled mice were randomly divided into themodel(PCOS)group,the positive drug daunin-35(02 mg kg*.d)group and the BBR(100 kg*1:d-)groups,6mice in each group,were given the co
12、rresponding drugs for 14 d.Feces were collected from the colon of the mice,and 16SrDNA sequencing was used to detect intestinal flora;mice were weighed,and morphological changes of vaginal exfoliatedcells were observed;serum sex hormone and insulin levels were detected;HE staining was used to observ
13、e the pathologicalstructure of the ovary;immunohistochemistry was used to detect the expression of Claudin-1 and Occludin in the colon ofmice;and Westerm-blot was used to detect the expression of proteins related to the PBK/AKT pathway in the ovary tis-sues.Results The 16S rDNA sequencing showed tha
14、t the diversity of intestinal flora in the PCOS group was changedcompared with that in the normal control group.At the genus level,the abundance of harmful bacteria such as Blautia,Fu-sobacterium spp.,Coccidioides immitis,Coccidioides twins and Clostridium spp.was increased in the PCOS group compare
15、dwith the normal control group,while the disordered state of the intestinal flora of the mice was improved by BBR,and theabundance of beneficial bacteria,such as Lactobacilus spp.,was increased.Compared with the normal control group,mice inthe PCOS group had reduced levels of estradiol(E2),folicle-s
16、timulating hormone(FSH),and insulin sensitivity index(ISI)(t/P=2.847/0.0173.079/0.012,3.541/0.005),body mass and testosterone(T),luteinizing hormone(LH),LH/FSH,fasting glucose(FPG),fasting insulin(FINS),and insulin resistance index(HOMA-IR)levels were elevated(t/P=4.782/0.013,4.626/0.001,5.703/0.001
17、,and 2578/0.028,4.156/0.002,3.255/0.009,7.439/0.001),disturbances in the motility cycle,light microscopicovarian structures consistent with PCOS pathology,and decreased expression of Claudin-1,Occludin,p-PI3K/PI3K,andp-AKT/AKT(t/P=3.806/0.003,3.795/0.004,13.474/0.001,17285/0.001).Compared with the P
18、COS group,E2,FSH,and ISIlevels were elevated(t/P=2.389/0.0383.354/0.007,3.198/0.010),and body mass and T,LH,LH/FSH,FINS,and HOMA-IR lev-els were decreased in the darbepoetin-35 group(t/P=3.133/0.011,3.416/0.007,4.596/0.001,2.327/0.042,2.908/0.016,6.096/0.001),improved motility cycle and ovarian stru
19、cture,Claudin-1,Occludin,p-PI3K/PI3K and p-AKT/AKT expression was el-evated(t/P=2.390/0.038,2247/0.048,7323/0.001,7.564/0.001);BBR group ISI levels were elevated(t/P=3.198/0.010),andbody mass and T,LH,LH/FSH,FPG,FINS,HOMA-IR levels were decreased(t/P=3.668/0.004,4.602/0.001,6.101/0.001,2.535/0.030,5
20、.950/0.001,2.914/0.015,7.630/0.001),improved motility cycle and ovarian structure,improved levels of Clau-din-1,Occludin,p-PI3K/PI3K and p-AKT/AKT expression was elevated(t/P=3.799/0.003,3.185/0.010,7.473/0.001,8.187/0.001).Conclusion Letrozole-induced PCOS mice have dysbiosis,BBR may help to activa
21、te the PI3K/AKT pathway andimprove the intestinal barrier function by regulating the distribution of intestinal flora to achieve the therapeutic purpose ofPCOS.Key words Polycystic ovary syndrome;Flavopiridol;Intestinal flora;PI3K/AKT signaling pathway;Mice多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是女性最
22、常见的生殖内分泌疾病,也是育龄期女性不孕的重要原因 。PCOS发病机制较为复杂,其治疗方法具有局限性。因此,寻找有效的治疗药物至关重要。黄连素(berberine,BBR)是一种天然异喹啉生物碱,具有降糖、降脂和抗炎等有益作用。据报道,BBR对 PCOS显示出良好的临床疗效 2 ,但其具体机制尚未可知。研究表明,肠道菌群及其代谢产物失调与PCOS的生殖和代谢表型存在联系 34,靶向调节肠道菌群可改善PCOS5-6。由于BBR吸收率低,其分解代谢主要集中在胃肠道,可能有效调节肠道菌群和肠道黏膜屏障 7 。因此,本研究采用来曲唑诱导的PCOS小鼠模型,利用16 S rDNA 基因测序技术,研究BB
23、R对PCOS肠道菌群的调节作用及可能机制,报道如下。353.1 材料与方法1.1材料(1)动物:清洁级健康雌性C57BL/6J小鼠2 4只,6 8 周龄,体质量15 2 0 g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,合格证号:SCXK(京)2020-0004。饲养在特定的无菌条件下,标准温度(222),相对湿度45%7 0%,光暗周期12/12 h,并给予自由饮水和标准饮食。屏障环境适应1周后进行后续实验。(2)试药试剂:来曲唑(货号H199991001)购自江苏恒瑞医药公司;达英-35(货号j20140114)购自德国拜耳公司;黄连素(批号B21449)购自上海源叶生物公司;睾酮(T,货号H
24、090-1-1)、雌二醇(E2,货号H102-1-1)和促黄体生成素(LH,货号H206-1-2)购自南京建成公司;空腹胰岛素(FINS,货号ml060484)和卵泡刺激素(FSH,货号ml059034)ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物公司;HE检测试354.剂盒(货号G1003)购自武汉塞维尔生物公司;抗Oc-cludin(G B11140 1)、Cl a u d i n-1(G B140 6 6)抗体购自美国Servicebio公司;抗PI3K(42 55S)和PI3K-p85(42 92 S)抗体购自美国CST公司;抗AKT(a b 8 8 0 5)和AKT-pT30磷酸化抗体(ab
25、32445)购自美国Abcam公司。(3)仪器设备:离心机(AXTCL16M)购自江苏恒诺仪器制造有限公司;切片机(RM2235)和石蜡包埋机(G1150H)购自德国徕卡公司;I-Sanger生信云平台(htps:/www.i- 0 2 1年6 月一2022年6 月在复旦大学附属上海市第五人民医院实验动物中心进行实验。采用随机数字表法将2 4只雌鼠分为正常对照组、模型(PCOS)组、阳性药达英-35(0.2 mgkg-1.d-1)组和 BBR(100 mgkg-1.d-1)组,每组6 只。除正常对照组外,其余小鼠均予以来曲唑(1 mgkg=1.d-1,溶于1%羧甲基纤维素)灌胃诱导PCOS模型
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