建立大规模筛选病毒的核酸检测方法 (1).pdf
《建立大规模筛选病毒的核酸检测方法 (1).pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《建立大规模筛选病毒的核酸检测方法 (1).pdf(6页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、基金项目:国家重点研发计划项目(SQ2020YFA080008)作者单位:200433上海,复旦大学生命科学学院通信作者:张经纬,电子信箱:Jingwei_zhang 建立大规模筛选病毒的核酸检测方法梁雪石云峰张经纬摘要目的开发快速、简便、可大规模对病毒进行筛选的核酸检测方法。方法通过集液滴生成、循环扩增、信号读取为一体的液滴数字聚合酶链反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)系统,以严重急性呼吸综合征冠状病毒 2(se-vere acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2
2、)的 ORF1ab 和 N 基因为靶序列,以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyc-eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参基因,进 行 核酸 扩增 并 监测 每个 液滴 的 荧光 信号。结 果 一体 式DDPCR 仪实现了“样本进-结果出”的简易操作。其水油体系与 SARS-CoV-2 检测试剂盒中试剂兼容,至扩增结束液滴稳定未融合,实现了实时检测区分出大量液滴中不同的荧光信号。恒温扩增条件下,最早可在第 9min 观察到带有三重荧光信号(FAM、HEX、CY5)的液滴。扩增过程中的实时荧光信号通过拟合后与实时荧光定量聚合酶链反应扩增曲线类似,
3、包括基线期、指数期和平台期。各基因几百个液滴的扩增曲线显示,各液滴中无特异性扩增,同时 Ct 值分析结果显示,最早可在第 12min 得到扩增信号,达到鉴别目的。结论一体式 ddPCR 仪操作简便,液滴中反应迅速,可达到快速检测的目的。恒温扩增对反应设备要求较低,可大规模批量反应,同时拍照式信号采集可记录大量液滴的荧光信号,达到大规模筛选的目的。关键词一体式液滴数字聚合酶链反应严重急性呼吸综合征冠状病毒 2恒温扩增中图分类号R331文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2024.04.006Establishment of Nucleic Acid Detec
4、tion Methods for Large-scale Screening of Viruses.LIANG Xue,SHI Yunfeng,ZHANG Jingwei.School of Life Science,Fudan University,Shanghai 200433,ChinaAbstractObjectiveTo develop rapid and simple nucleic acid assays for large-scale screening of epidemic viruses.MethodsThe droplet digital polymerase chai
5、n reaction(ddPCR)system,which integrates droplet generation,cyclic amplification,and signal read-ing,was used to amplify nucleic acids and monitor the fluorescence signal of each droplet targeting the ORF1ab and N genes of severe a-cute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2)and human glycera
6、ldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)gene asinternal reference gene.ResultsThe integrated DDPCR instrument operated on the simple principle of“sample in-result out.”Its wa-ter-oil system was compatible with the SARS-CoV-2 assay kits reagents,and the droplets were stable and unfused by the end of
7、am-plification,allowing real-time fluorescence detection to distinguish different fluorescence signals in a large number of droplets.Dropletswith triple fluorescence signals(FAM,HEX,CY5)were observed as early as the 9th minute under thermostatic amplification conditions.By fitting,the real-time fluo
8、rescence signal during amplification resembled the real-time polymerase chain reaction amplification curve,including the baseline,exponential,and plateau phases.The amplification curves of several hundred droplets of each gene showed thatthere was no specific amplification in each droplet,while the
9、results of Ct value analysis showed that the amplification signal could be ob-tained at the 12th minute at the earliest for identification purposes.ConclusionThe integrated ddPCR instrument is simple to operateand reacts quickly in droplets,allowing for rapid detection.Thermostatic amplification req
10、uires less reaction equipment and is suitable forlarge-scale batch reactions,whereas photo-type signal acquisition can record the fluorescence signal of a large number of droplets forlarge-scale screening.Key wordsIntegrated droplet digital polymerase chain reaction;SARS-CoV-2;Thermostatic amplifica
11、tion核酸扩增(nucleic acid amplification,NAA)检测是一种快速的 分子检测 技 术,包 括 聚 合 酶 链 反 应(polymerase chain reaction,PCR)及其他等温扩增技术1。传统 PCR 检测均在大型、昂贵的热循环仪中进行,升降温缓慢。通过减小反应体积、增加反应接触面与反应体积的比值、重新设计仪器中对温度传导或控制的原件来加快反应时间2 4。然而,这些设备都更为精密和复杂。虽然各种等温扩增技术被开发出来以规避 PCR 循环中对温度的需求,但这些技术都有不同程度的非特异性反应5,6。由病原体严重急性呼吸系统综合征冠状病毒 2(severea
12、cuterespiratorysyndromecoronavirus2,42论著J Med Res,April 2024,Vol.53 No.4SARS-CoV-2)引起的人类急性呼吸道综合征对全球健康和经济的影响持续至今。目前诊断 SARS-CoV-2 感染的金标准是基于反转录实时荧光定量PCR(reversetranscriptionquantitativePCR,RT-qPCR),但其判断阈值较为主观7。液滴数字 PCR(droplet digital PCR,ddPCR)基于水油系统形成油包水液滴,包含在待测样品中的目标核酸分子被分隔在热稳定的独立液滴中平行地进行 PCR 反应。如今,
13、几个 ddPCR 平 台 也 已 商 业 化,如 RaindropTM数 字PCR、Bio-Rad QX200TMDroplet DigitalTM系 统、Na-icaTM系统,但使用这些平台完成一次检测,大多都需要几台设备协同,如液滴生成仪、液滴读取仪、PCR热循环仪等8。鉴于快速 PCR 系统精密复杂,恒温扩增产生的非特异性不可避免,本研究试图利用反转录液滴实时恒温扩增的方式,建立快速且设备简单的检测体系。目前已有的研究仅能处理液滴的平均荧光信号或少量液滴的实时荧光信号,虽然 BioMarkTMHD 系统可同时实现荧光定量 PCR(quantitative PCR,qPCR)和实时数字 P
14、CR(digital PCR,dPCR),但需要其他采样设备,检测成本高昂9。除了对少量液滴进行实时扩增外,也有研究可对大量液滴的荧光信号进行实时监测。如一项研究使用硅衬底制造了约 20000 个微室的芯片对质粒进行 dPCR 扩增,在每个延伸阶段的最末端同时记录和分析了荧光图像,再基于建立的分析模型对阳性和阴行扩增曲线进行分析10。另一项研究虽然也能通过拍照处理大量液滴的实时扩增曲线,但其也需配套对应的微流控芯片阵列11。因此,相较于操作步骤繁琐且需配备外围设备甚至精密芯片的实时液滴扩增技术,研究人员利用新型液滴生成方式 振动注射技术,通过枪头前端的匀速摆动生成大小均一的微滴,打造了一款集液
15、滴生成、扩增和结果读取于一体的全自动 ddPCR仪(图 1),大幅减少了外围配套设备及耗材,缩短了实验时间,降低了实验成本。图 1实验流程图材料与方法1.引物设计:根据 2020 年 3 月 21 日发布在 GI-SAID25 和 GenBank 上的 SARS-CoV-2 基因组,使用 Primer Explorer v.5 进行引物设计,设计方法如研究所述12。引物包括人 GADPH 基因作为样本内部对照,ORF1ab 基因和 N 基因引物共同检测病毒。2.试剂介绍:SARS-CoV-2 检测试剂盒购买于南京普济生物有限公司,其中含有引物及探针混合液;PCR buffer mix(内含反转
16、录酶、DNA 聚合酶以及缓冲离子);对照品包括空白对照(无核酸酶的水)、52医学研究杂志 2024 年 4 月第 53 卷第 4 期论著阴性对照(仅含人 GAPDH 部分序列)和阳性对照(SARS-CoV-2 病毒的 ORF1ab 基因、N 基因,以及人的内参基因 GADPH);Buffer A(具有细胞裂解功能)。3.实验操作:6.4l PCR Buffer mix,2.4l 引物及探针混合液,7.2l Buffer A,4l 对照 品,0.5lROX 参比染料。将 4 孔板和 4 孔板密封盖分别放置到 4 孔板托盘架和 4 孔板压盖板架上,一起放入机器内。将枪头盒放入样本架中,并在枪头盒左
17、侧储油池处倒入液滴生成油,完成后将盛放枪头盒的样本架放入机器内。将待测样品放置在样本架右侧的八连管凹槽上,开启仪器将自动生成液滴,22l 的待测样品理论将生成为 23000 个微液滴。样品生成液滴后,于61 运行 60 90min。扩增同时,机器内置的荧光检测器负责采集不同荧光通道的液滴图像。4.数据处理:实时捕获液滴的荧光强度(1 分钟/次),选 择 仪 器 参 数 在 HEX(GAPDH 基 因)、FAM(ORF1ab 基因)、CY5(N 基因)荧光通道的图片,通过 Image J 软件合并图像,并进行灰度处理,得到的灰度值拟合成曲线。确定液滴数字等温扩增的周期阈值(Ct)数:每个荧光通道
18、阈值被设定为(最小值+最大值)Y%,Y=5 为每条扩增曲线确定交叉点 Ct 数。结果1.一般液滴系统的水相和油相与常规核酸扩增溶液兼容,但本实验使用的 SARS-CoV-2 检测试剂盒含有表面活性剂。为了测试该表面活性剂与已有水油系统兼容,选择无核酸酶的水为对照,实验首先测试了试剂盒中 Buffer A 与液滴生成系统的兼容性,结果如图 2 所示。将 3 个荧光通道的照片合并成一张,其中 ORF1ab 扩增的 FAM 信号呈蓝色,N 基因扩增的 CY5 信 号 呈 红 色,内 参 基 因 GAPDH 扩 增 的HEX 信号呈绿色,3 种颜色重叠呈现出图中的白色液滴。根据图片结果,对于无核酸酶的
19、水,可第 9min 观察到扩增信号(白色液滴),达到荧光观测阈值。对于具有细胞裂解功能的 Buffer A,在第 19min 呈现出白色液滴,表现出扩增信号。Buffer A 扩增体系至反应结束未见液滴融合,说明在有用于细胞裂解的表面活性剂情况下扩增系统依然稳定,并且未影响各基因的扩增,依然可成功区分阳性对照(FAM、HEX、CY5三重信号),内参信号(仅 HEX)和空白液滴。图 2Buffer A 与液滴系统的兼容性A C.无核酸酶的水;D F.Buffer A。A、D.液滴生成结束;B、E.初见荧光信号(白色液滴);C、F.扩增结束 2.传统核酸扩增检测时,成千上万条核酸序列在PCR 管中
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 建立大规模筛选病毒的核酸检测方法 1 建立 大规模 筛选 病毒 核酸 检测 方法
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。