京尼平苷对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞增殖及血管生成的影响及机制研究.pdf
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2、究方向:白 内 障、眼 底 病。:通信 作 者:蒋 利 生(:),男,年 月出生,河北人,副主任医师。研究方向:眼底病。:收稿日期:修回日期:本文编辑:付中静基金项目:河北省教育厅高等学校科 学 技 术 研 究 项 目(编 号:);河北省医学科学研究课题计划(编号:)作者单位:河北省唐山市,华北理工大学附属医院眼科(苏杰,杨馥宇,李猛);河北省唐山市,滦州市人民医院眼科(蒋利生)【摘要】目的研究京尼平苷()对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞()增殖、迁移及血管形成能力的影响,并探讨其作用机制。方法采用不同浓度(、)干预 ,检测 对 细胞增殖活性的影响。将 分为对照组,高糖()组,低、中、高浓度(
3、、)组,贝伐珠单抗(,)组和 高浓度 ()组。检测细胞增殖活性;划痕实验检测细胞迁移能力;体外成管实验检测细胞成管能力;检测细胞中血管内皮生长因子 ()、可溶性 受体 ()、基质金属蛋白酶 ()和基质金属蛋白酶 ()等蛋白表达水平。结果与 比较,、对 增殖活性的影响差异均无统计学意义(均为 )。与对照组比较,高糖组 增殖活性和迁移能力均显著增强(均为 ),细胞环形管状结构增多,、和 蛋白表达水平均升高(均为 ),蛋白表达水平降低()。与高糖组比较,各浓度组和 组细胞增殖活性和迁移能力均减弱(均为 ),细胞环状结构减少,、和 蛋白表达水平均显著降低(均为 ),蛋白表达水平均升高()。与 高浓度组
4、比较,高浓度 组细胞增殖活性显著减弱(),细胞环状结构减少,、和 蛋白表达水平均显著降低(均为 ),蛋白表达水平显著升高()。结论 可抑制高糖诱导的 增殖、迁移与血管形成,其作用机制可能与调控 轴平衡有关。【关键词】京尼平苷;视网膜血管内皮细胞;血管内皮生长因子;可溶性 受体 ;血管形成【中图分类号】糖尿病视网膜病变()是一种与长期糖尿病相关的微血管疾病,大约 的糖尿病患者会受到 影响 。发病机制复杂,包括氧化应激、炎症反应、新生血管等多种因素 。在 最后阶段,血管内皮生长因子()异常产生并释放,导致新生血管形成,而视网膜新生血管是导致视网膜脱离、玻璃体积血和视力下降的主要原因 。目前,抗 药
5、物成为了 治疗的一线选择,如贝伐珠单抗()。然而,在哺乳动物体内存在一种内源性 抑制剂,即可溶性 受体 (),其能够与 结合,抑制 分子功能,但正常生理条件下,与 处于动态平衡状态,起到相互制约的作用。有研究表明 ,过表达 可显著抑制视网膜血管生成。因此,内源性 分子轴可能成为治疗 的关键靶点。京尼平苷()是一类环烯醚苷类化合物,具有抗肿瘤、抗糖尿病、抗心肌功能障碍等多种药理活性 。在 体外和体内模型中均发挥着抑制氧化应激和炎症反应的作用,可减轻视网膜细胞和视网膜屏障的损伤 。具有抑制 表达作用,从而阻止血管生成 。因此,本研究推测 可能通过调控内源性 分子轴对 患者血管新生产生抑制作用。本研
6、究拟通过高糖条件培养人视网膜血管内皮细胞()模拟体外高糖模型,研究 对 增殖和血管形成能力的影响,并探讨其作用机制,旨在为 治疗研究提供新的实验依据。材料与方法 细胞与主要试剂 购自武汉普诺赛生命科技有限公司。()购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;、胎牛血清均购自美国 公司;试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;购自美国 公司;基质胶购自美国 公司;兔抗人 多克隆抗体、兔抗人基质金属蛋白酶 ()多克隆抗体、兔抗人基质金属蛋白酶 ()多克隆抗体、兔抗人 多克隆抗体均购自英国 公司;兔抗人 多克隆抗体购自美国 公司。检测 增殖活性()取对数生长期 ,以每孔 个眼 科新进展 年 月第 卷第 期 :细胞
7、的密度接种于 孔板中,待细胞生长至约 融合度时,采用不同浓度(、)处理 。()取对数生长期 ,以每孔 个细胞的密度接种于 孔板中,待细胞生长至约 融合度时,加入含 葡萄糖的 诱导 ,同时分别加入不同浓度(、)或 ,培养 。培养结束前 ,每孔加入 溶液,孵育 。酶标仪检测 处吸光度,计算细胞增殖活性。细胞分组处理将对数生长期的 分为:对照组,高糖组,低、中、高浓度组,组和 高浓度 组。除对照组采用含 葡萄糖的 进行培养外,其他组均采用含 葡萄糖的 培养。低、中、高浓度分别为、,组、高浓度 组中 浓度均为 ,高浓度 组中的 浓度为 。划痕实验检测 迁移能力实验前于 孔板背后,每隔 划一道横线,横穿
8、过孔。取对数生长期 接种于该 孔板,每孔加 个细胞,培养过夜。用无菌枪头垂直于孔板背后横线进行划痕,洗去划落的细胞,按照 中分组加药干预后培养 ,显微镜下观察划痕处细胞迁移情况。计算划痕愈合率()(划痕面积 划痕面积)划痕面积 。体外成管实验检测 成管能力取对数生长期 ,按照 中分组加药处理 。提前取 基质胶铺设于 孔板中,每孔 ,静置 备用。收集加药处理后的各组细胞,制备单细胞悬液,向 孔板中加入细胞悬液,每孔 ,培养 。显微镜下观察随机视野中细胞成管情况。检测 中 、和 蛋白表达水平取对数生长期 ,按照 中分组加药处理 。取所有组细胞沉淀,裂解提取总蛋白,法进行蛋白定量。电泳后,湿转法将蛋
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