基于mRNA组学构建弥漫大B细胞淋巴瘤预后模型.pdf

基金项目:徐州市科技计划重点研发项目(KC21207)通信作者,E-mail:13952269920lhh 基于 mRNA 组学构建弥漫大 B 细胞淋巴瘤预后模型王玉波,马东慎,骆丹,范美婷,刘慧(徐州医科大学附属医院病理科,江苏 徐州 221002)摘要:目目的的 根据 mRNA 组学数据筛选弥漫大 B 细胞淋巴瘤(DLBCL)预后相关基因并建立预后模型。方方法法 从 TCGA 数据库下载 NCICCR-DLBCL 数据集中 234 例 DLBCL 患者 mRNA 组学数据和预后数据作为训练集,从 GEO 数据库下载 GSE87371 数据集中 223 例 DLBCL 患者相应数据作为验证集,通过 Cox 回归分析、Kaplan-Meier 分析和 LASSO 分析建立预后模型,结合生存曲线和 ROC 曲线验证模型的准确性。采用免疫组化法验证117 例 DLBCL 组织中 CD70 蛋白的表达及其与预后的关系。结结果果 构建包含 14 个独立预后预测 mRNA(ANO3、ZNF93、RAD9B、PROC、ZSCAN20、RBBP9、SLC18B1、CXorf21、MUC12、CYP2U1、VSIG4、CCDC178、CD70、GHRH)的预后模型。高风险组生存时间显著短于低风险组(P0.000 1),ROC 1 年、3 年和 5 年生存率曲线下面积分别为0.92、0.90 和 0.91。CD70 阳性组与阴性组的 Kaplan-Meier 生存曲线差异有统计学意义(P=0.009 4),阳性组生存时间较短。结结论论 成功建立了基于 mRNA 表达的 DLBCL 预后预测模型,为 mRNA 转录组学在 DLBCL 预后预测中的实际应用提供了可行性方案,并在临床样本中证实 CD70 高表达与 DLBCL 预后密切相关,可作为临床预后评价的指标之一。关键词:mRNA;CD70;弥漫大 B 细胞淋巴瘤;TCGA 数据库;预后模型;生存分析中图分类号:R733.4 文献标志码:A 文章编号:2096-3882(2024)03-0195-07DOI:10.3969/j.issn.2096-3882.2024.03.008Establishment of a prognostic model for diffuse large B-cell lymphoma based on mRNA omicsWANG Yubo,MA Dongshen,LUO Dan,FAN Meiting,LIU Hui(Department of Pathology,the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University,Xuzhou,Jiangsu 221002,China)Abstract:Objective To screen the prognosis-related genes for diffuse large B-cell lymphoma(DLBCL)based on mRNA omics data and establish a prognostic model.MethodsThe mRNA-omics data and prognostic data of 234 DLBCL patients in the NCICCR-DLBCL dataset were downloaded from the TCGA database as a training set,while the corresponding data of 223 DLBCL patients in GSE87371 dataset were downloaded from GEO database as a validation set.A prognostic model was established through Cox regression analysis,Kaplan-Meier analysis and LASSO analysis,and its accuracy was validated by Kaplan-Meier survival curve and ROC curve.Finally,the expression of CD70 protein was detected in 117 DLBCL tissues by immunohistochemistry.Results The prognostic model was established,which contained 14 significantly independent mRNA marker(ANO3,ZNF93,RAD9B,PROC,ZSCAN20,RBBP9,SLC18B1,CXorf21,MUC12,CYP2U1,VSIG4,CCDC178,CD70,and GHRH).The high risk group showed remarkably shorter median survival time than the low risk group(P60 岁118(50.4)107(48.0)性别 男139(59.4)116(52.0)女95(40.6)107(48.0)分期 40(17.1)29(13.0)69(29.5)42(18.8)62(26.5)35(15.7)59(25.2)117(52.5)未知4(1.7)0(0)国际预后指数 高风险23(9.8)50(22.4)高-中风险44(18.8)54(24.2)中-低风险45(19.2)45(20.2)低风险81(34.6)74(33.2)未知41(17.5)0(0)生存状态 存活136(58.1)53(23.8)死亡98(41.9)168(75.3)691徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(3)续表 1临床特征训练集(n=234)验证集(n=223)未知0(0)2(0.9)1 年生存时间 1 年186(79.5)195(87.5)1 年39(16.7)3(1.3)未知9(3.8)25(11.2)3 年生存时间 3 年141(60.2)111(49.8)3 年68(29.1)66(29.6)未知25(10.7)46(20.6)5 年生存时间 5 年118(50.4)16(7.2)5 年79(33.8)154(69.0)未知37(15.8)53(23.8)1.2 研究对象 收集 20192021 年徐州医科大学附属医院确诊的 117 例 DLBCL 患者作为研究对象。所有 DLBCL 均依据 WHO(2008)诊断标准和 2016年修订标准11 确诊,并应用 Hans 法则进行分型。由 2 位经验丰富的病理医师进行 H-E 染色、免疫组化阅片。1.3 分析方法采用 R 软件进行预后模型分析。从训练集的 mRNA 转录组测序结果中获得基因表达量的 FPKM 值,采用 Z-score 标准化后,根据每个基因中位表达量将病例分为该基因高表达和低表达组,分别进行单基因 Cox 回归分析和单基因 Kaplan-Meier(K-M)生存分析,筛选出 2 种分析方法中 P0.05 的 mRNA。采用 LASSO 回归分析进一步缩小目标基因范围。采用多因素 Cox 回归构建风险比例模型。采用 survminer 程序包的 surv_cutpoint 函数寻找最佳风险分数的临界值,根据此临界值将训练集所有样本分为高风险组和低风险组。采用 K-M 曲线及时间依赖性受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)对预测模型进行评估。最后,采用来源于 GEO 数据库的基因表达芯片数据进行验证,根据建好的模型计算各病例的风险系数,采用 K-M 和 AUC 评估模型预测效果。1.4 免疫组化 收集 117 例 DLBCL 患者病理蜡块并制作组织芯片,切片后行 H-E 染色及免疫组化双染色。一抗包括 CD20、PAX-5、CD10、BCL-6、BCL-2、MUM1、C-MYC、CD3、CD5、Ki-67 等,购自北京中杉金桥公司,CD70 鼠抗人单克隆抗体购自美国 Proteintech 公司,克隆号 67749-1-lg。结果判定:CD70 阳性定位于细胞膜,将所有病例分为阴性(-)组和阳性(+)组。1.5 随访 以门诊或电话方式进行随访,所有患者随访 172 个月,随访内容包括患者生活质量、一般情况、近期复查情况等。总生存期指自病理确诊至因任何原因死亡的时间。1.6 统计学分析 采用 SPSS 27.0 软件进行统计学分析,DLBCL 中 CD70 表达与临床病理特征的关系行 Pearson 2检验,若理论频数 T5 且 T1,采用2检验的连续校正公式,若理论频数 T1,采用2检验的 Fisher 精确概率法。生存分析采用 Kaplan-Meier 分析。以双侧 P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 DLBCL 预后模型的建立从训练集中获得17 776 个 mRNA 的表达信息,从中筛选出单基因Cox 回归分析 P0.05、单基因 K-M 生存分析 P0.05 且与预后潜在相关的 mRNA 共 1 183 个。其中 1 107 个为验证集和训练集共有,用于后续分析。对上述 1 107 个 mRNA 进行 LASSO 回归以进一步压缩参数。为了得到简洁的模型,采用最小化平均交叉验证误差 值的 1 个标准误差内的最大值(lambda.1se)作为最佳 值,共筛选出 44 个 mRNA791徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(3)纳入后续分析。进一步采用多因素 Cox 回归构建预后预测模型。14 个基因是独立预后预测因子(P1,表明这 8 个基因可能是影 响 DLBCL 患 者 预 后 的 危 险 因 素;ANO3、ZNF93、RAD9B、PROC、ZSCAN20、RBBP9的 HR1,表明这 6 个基因可能是影响 DLBCL 患者预后的保护因素。2.2预后风险模型及生存分析见图 1。根据构建好的模型计算各样本的风险分数,采用 surv_cut-point 函数确定训练集最佳风险分数临界值为 0.14,并根据此临界值将训练集分为高风险组和低风险组(图 1A),K-M 分析发现高风险组生存时间短于低风险组(P0.000 1,图 1B)。A.训练集中患者的风险评分,垂直虚线左侧点代表低风险患者,右侧点代表高风险患者,垂直虚线为低风险患者和高风险患者风险评分临界值;B.训练集 mRNA 预测模型中患者的 Kaplan-Meier 生存曲线图;C.训练集 mRNA 预测模型中风险得分预测患者 1 年、3 年和 5 年生存率的 ROC 曲线:D.验证集高低风险组 Kaplan-Meier 曲线;E.验证集时间依赖 ROC 曲线图 1 训练集及验证集 DLBCL 患者生存分析 高风险组和低风险组 1 年生存率分别为59.4%和 94.7%,3 年生存率分别为 32.7%和81.2%,5 年生存率分别为 19.8%和 73.7%。ROC曲线分析结果显示,模型预测患者 1 年生存率的 891徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(3)AUC 值为 0.92,3 年生存率的 AUC 值为 0.90,5 年生存率的 AUC 值为 0.91(图 1C)。采用验证集进行验证,根据模型计算风险分数并确定最佳风险分数临界值为 3.07,与训练集结果一致。生存曲线同样证明高、低风险组总生存时间差异有统计学意义(P60 岁患者占比明显高于 CD70 阴性组,差异有统计学意义(P 0.05)。见表 2。A.CD70 表达阴性;B.CD70 表达阳性图 2 CD70 在 DLBCL 组织中的表达(40,免疫组化染色)表 2 DLBCL 组织中 CD70 表达与临床特征的关系例(%)临床病理参数CD70阴性(n=70)阳性(n=47)2 P年龄 60 岁40(57.1)13(27.7)0.0020.012 60 岁30(42.9)34(72.3)性别 女41(58.6)21(44.7)0.1400.125 男29(41.4)26(55.3)Hans 分型 GCB 型23(32.9)15(31.9)0.9150.413 non-GCB 型47(67.1)32(68.1)Ann Arbor 分期 44(62.9)33(70.2)0.4110.559 26(37.1)14(29.8)IPI 评分 低危(02 分)56(80.0)38(80.9)0.6770.210 高危(35 分)12(17.1)7(14.9)未知2(2.9)2(4.2)白蛋白 正常43(61.4)30(63.8)0.6790.019 异常27(38.6)16(34.1)未知0(0.0)1(2.1)LDH 值 正常41(58.6)26(55.3)0.7900.374 异常27(38.6)19(40.4)未知2(2.8)2(4.3)991徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(3)2.5 CD70 阳性组和 CD70 阴性组 DLBCL 患者的预后 Kaplan-Meier 生存曲线示,CD70 阳性组与阴性组生存曲线的差异有统计学意义(P=0.009 4),阳性组生存时间较短(图 3)。2.6DLBCL 中临床与病理学重要参数的多因素Cox 回归分析 选择重要的与预后相关的临床与病理学参数进行多因素 Cox 回归分析,其中年龄(P=0.046)、白蛋白(P=0.034)、CD70(P=0.049)均为影响 DLBCL 的独立影响因素。见表 3。图 3 CD70 阳性组和 CD70 阴性组DLBCL 患者的生存曲线表 3 DLBCL 中临床与病理学重要参数多因素 Cox 回归分析影响因素多因素 Cox 回归分析Exp(B)95%CIP年龄3.8001.02214.1250.046IPI 评分0.9320.2603.3400.914白蛋白3.8511.10813.3850.034LDH0.3770.1412.1020.544Hans 分型3.5410.90113.9240.070CD702.7301.0067.4060.0493 讨 论DLBCL 于任何年龄均可发病,发病率随年龄增长呈现上升趋势。为改善 DLBCL 患者的临床预后,延长患者生存时间,探寻潜在的生物标志物并建立高质量预后模型是目前急需解决的问题。本研究基于 NCICCR 数据集的 mRNA 测序数据开发出 DLBCL 预后模型,并采用 GEO 数据库基因表达芯片平台的 mRNA 数据进行验证,发现该模型对 DLBCL 患者的预后具有较强的评估能力。本研究在筛选用于建立 DLBCL 预后模型的影响因素时,联合使用了单因素 Cox 回归分析、K-M 生存分析、LASSO 回归分析和多因素 Cox 回归分析这 4 种生物信息学分析工具。其中 LASSO 回归分析可以从众多 DLBCL 相关 mRNA 中筛选出与患者预后密切相关的核心 mRNA,在不降低模型临床预测能力的基础上优化模型,减少无关因素对预测水平的影响。此外,在单因素 Cox 回归分析的基础上,本研究利用多因素 Cox 回归分析对 mRNA 做进一步筛选,提高了预后预测模型的预测效能,并且通过风险分层对高风险与低风险人群进行差异化生存评价,展现了模型对不同人群生存状态的精准预测效能。此外,本研究的验证集采用与训练集不同的转录组芯片数据进行独立外部验证,提示本模型具备一定的跨平台预测能力。本研究最终筛选得到 14 个作为独立预测因子的基因,现已证实大部分基因在各类恶性肿瘤的迁徙和侵犯生物学行为中均具有显著的调节作用,其中CCDC178和CYP2U1的 mRNA 水平与预后不良的相关性最为显著。CCDC178 是一种卷取线圈结构域蛋白,相关研究显示,CCDC178 通过促进细胞外调节蛋白激酶(ERK)激活等一系列途径促进肿瘤细胞锚定非依赖性生长,促进肿瘤体内转移12。CYPs 对内源性和外源性生物活性物质具有相关催化作用,包括异生代谢、药物和一些内源性物质代谢,这些物质代谢激活细胞并刺激细胞信号通路,如花生四烯酸代谢、类固醇代谢、脂肪酸代谢在不同肿瘤中选择性表达,介导多种致癌物的代谢活化,并参与肿瘤治疗药物的生物转化13。CD70 是肿瘤坏死因子受体家族成员 CD27 的细胞配体,在包括淋巴瘤在内的多种恶性肿瘤中表达,虽然其作用尚不完全清楚,但 CD70 的激活与细胞增殖和存活有关,这增加了其作为恶性 B 细胞激活受体和 T 细胞反应抑制剂发挥作用的可能性14。早期研究认为,CD70 的表达仅限于在抗原诱导下高度活化的 T 细胞/B 细胞,并且随着抗原刺激的减少而表达下调。002徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(3)而且相关研究发现,血液恶性肿瘤以及实体肿瘤,如鼻咽癌、胸腺癌和脑肿瘤也表达 CD7015。另外,靶向 CD70 抗肿瘤药物的研究已经取得较大进展,一些靶向 CD70 的药物被开发并获准进入临床试验阶段,其中针对 DLBCL 抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate,ADC)SGN-CD70A 已进入期临床试验阶段16-17,所以进一步探索 CD70 与 DLBCL 患者预后的相关性极为重要。本研究免疫组化实验结果提示,CD70 阳性组与阴性组的 Kaplan-Meier 生存曲线差异有统计学意义(P=0.009 4),阳性组生存时间较阴性组明显缩短。多因素 Cox 回归分析显示 CD70 是 DLBCL 预后的独立影响因素,进一步证实了 CD70 高表达与 DLBCL 的不良预后有关。CD70 有望成为治疗 DLBCL 的关键靶点之一。本研究通过生物信息学筛选出与 DLBCL 预后高度相关的一组 mRNA,成功构建一种高质量的DLBCL 预后预测模型并验证了其预测能力,为 mR-NA 转录组学在 DLBCL 预后预测中的实际应用提供了可行性方案,并为 DLBCL 预后预测模型的发展提供了新的思路。参考文献:1 Sasi BK,Martines C,Xerxa E,et al.Inhibition of SYK or BTK augments venetoclax sensitivity in SHP1-negative/BCL-2-positive diffuse large B-cell lymphoma J.Leukemia,2019,33(10):2416-2428.2 Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2019J.CA Cancer J Clin,2019,69(1):7-34.3 Reddy A,Zhang J,Davis NS,et al.Genetic and functional drivers of diffuse large B cell lymphomaJ.Cell,2017,171(2):481-494.4 Coiffier B,Thieblemont C,Van Den Neste E,et al.Long-term outcome of patients in the LNH-98.5 trial,the first randomized study comparing rituximab-CHOP to standard CHOP chemotherapy in DLBCL patients:a study by the Groupe d Etudes des Lymphomes de lAdulteJ.Blood,2010,116(12):2040-2045.5 He J,Chen ZW,Xue QF,et al.Identification of molecular subtypes and a novel prognostic model of diffuse large B-cell lymphoma based on a metabolism-associated gene signature J.J Transl Med,2022,20(1):186.6 Roth SC.What is genomic medicine?J.J Med Libr Assoc,2019,107(3):442-448.7 Brittain HK,Scott R,Thomas E.The rise of the genome and personalised medicineJ.Clin Med(Lond),2017,17(6):545-551.8 张钧栋,张皓旻,卢迪,等.弥漫大 B 细胞淋巴瘤预后相关差异表达自噬基因筛选及模型的建立J.中国实验血液学杂志,2022,30(4):1101-1108.9 孙晨蕊,肖琼,付昱,等.基于免疫基因的直肠癌预后模型的建立及验证研究J.中国实用内科杂志,2023,43(1):45-51.10 刘少博,黄波.基于生物信息学方法识别肺腺癌预后相关基因及预后风险模型的构建J.中国免疫学杂志,2021,37(23):2880-2892.11 Arber DA,Orazi A,Hasserjian R,et al.The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemiaJ.Blood,2016,127(20):2391-2405.12 Hu X,Zhao Y,Wei L,et al.CCDC178 promotes hepatocellular carcinoma metastasis through modulation of anoikis J.Oncogene,2017,36(28):4047-4059.13 Luo B,Chen C,Wu XY,et al.Cytochrome P450 2U1 is a novel independent prognostic biomarker in breast cancer patientsJ.Front Oncol,2020,10:1379.14 Claus C,Riether C,Schrch C,et al.CD27 signaling increases the frequency of regulatory T cells and promotes tumor growthJ.Cancer Res,2012,72(14):3664-3676.15 Grewal IS.CD70 as a therapeutic target in human malignanciesJ.Expert Opin Ther Targets,2008,12(3):341-351.16 杨凡,纪锋,郭志刚.靶向 CD70 抗肿瘤药物的研究进展J.中国肿瘤生物治疗杂志,2022,29(7):686-691.17 Phillips T,Barr PM,Park SI,et al.A phase 1 trial of SGN-CD70A in patients with CD70-positive diffuse large B cell lymphoma and mantle cell lymphoma J.Investig N Drugs,2019,37(2):297-306.收稿日期:2023-12-06 修回日期:2024-02-10本文编辑:李昕102徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(3)