型高效液相色谱仪操作规程.doc

Ultimate 3000型高效液相色谱仪操作规程一、 开机前的准备工作1. 检查设备电源、流路、信号连接是否完好。2. 流动相：配制相应的流动相，经0.45m微孔滤膜抽真空过滤后，超声脱气15分钟，必须使用色谱纯的溶剂，水或缓冲盐溶液要用超纯水；盛放样品溶液和流动相所用的玻璃容器必须用超纯水清洗。3. 样品溶液：按方法取样或配制标准样品溶液，0.45m滤膜过滤。二、 仪器的组成及开机平衡系统1. 仪器组成：本仪器由Ultimate 3000分离单元、DAD-3000（RS）检测器、Chromeleon 7色谱工作站和打印机组成。Ultimate 3000分离单元涉及四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机，可容纳120个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞密封垫清洗系统，溶剂托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。2. 开机：依次接通Ultimate 3000分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通 Ultimate 3000分离单元后，仪器开始自检约20s，打开电脑，双击电脑右下角的变色龙软件的服务管理器，单击“启动Chromeleon仪器控制器”，激活服务管理器，双击电脑桌面的“Chromeleon 7”图标，进入变色龙软件。3. 脱气（Degasssger）：向上掀开泵头前面板，拧松快速清洗阀（逆时针两圈左右），然后按“冲洗”键，泵将以3.0ml/min的速度自动快速清洗泵类残留的气泡，5min将自动停止。若想手动停止，只要再按“冲洗”键，将停止清洗。4. 清洗有缓冲盐的那个通道前后，一定要用超纯水清洗管路和泵头，以防止缓冲盐溶液直接与纯有机相混合而产生结晶堵塞比例阀。5. 清洗完毕，先停泵，再拧紧快速清洗阀。牢记不要在泵未停止清洗前拧紧快速清洗阀。三、 编辑仪器方法1. 在Chromeleon Console“创建”菜单中点击“仪器方法”。2. 采集时间和采集通道设立：在弹出的“仪器方法向导”窗口中输入分析运营时间；在“诊断通道”项下点击“取消选择所有通道”，点击下一步。3. LPG-3400 SD泵常规设立：在溶剂名称下面的方框中输入所用流动相的名字，如“%A：水，%D：甲醇”。 4. 在“压力限值”处的压力下限设立为5bar左右，可防治流动相走完时，仪器空走。压力上限设立为400 bar。5. 最大流速加速度和减速度可设立为3ml/min2，点击下一步。6. 泵流速梯度的设定：在“流速梯度”窗口中，图示为所设定的梯度曲线，下表中列有时间、流速、各通道流动相比例及梯度曲线。点击“删除平衡阶段”，然后再各项下输入相应值，在设定梯度过程中可以点击右边的“插入”行和“删除”行进行编辑。对反相色谱而言，一般梯度过程为水系比例越来越小，有机比例越来越多。7. WPS-3000：自动进样器的常规设立：一般吸取速度设立为2l/s，吸取延迟为7s，排出速度为10l/s，取样高度为2mm，进样冲洗设立为Before Inject，冲洗体积75l，冲洗速度4l/s，点击下一步。8. 进样模式：分析型液相色谱一般采用默认设立，低压梯度泵需勾选“与泵同步进样”，点击下一步。9. TCC-3100柱温箱常规设立：若需对色谱柱进行精确控温，则勾选“使用温度控制”，然后在“温度”后输入需要的温度值。其他各项均可采用默认值，点击下一步。10. UV（DAD-3000 RS）紫外二极管阵列检测器通道设定：二极管阵列检测器可以同时选择4个紫外通道采集数据，可以分别设定需要的检测波长，需要采集3D光谱时要选上3D FIELD，常规分析时可以选一个通道采集数据，一般参比波长选OFF，数据采集频率和相应时间可以通过勾选“使用推荐值”来设立。点击下一步。四、编辑解决方法和报告模板1. 在Chromeleon Console“创建”菜单中点击“仪器方法”。2. 选择“二维定量”，HPLC使用DAD检测器时可以选择“三维定量”，点击下一步。输入解决方法名称并选择保存位置，点击完毕。3. 在Chromeleon Console“创建”菜单中点击“报告模板”。4. HPLC使用DAD检测器时可以选择Default DAD，一般的检测器可以选择Default，点击下一步。输入报告模板名称并选择保存位置，点击完毕。五、创建一个新的序列文献1. 在Chromeleon Console“创建”菜单的下拉菜单中点击“序列”。2. 弹出“新建序列向导”页，在在线仪器框中，选中“HPLC”，点击下一步。依次在“进样名称的格式”、“样品数”、“进样次数”、“开始位置”、“进样量”输入相应值，点击下一步。点击“浏览”为新建的样品序列选择分析时所要采用的仪器方法、解决方法和报告模板。点击下一步，最后输入序列名称并选择保存途径，点击完毕。六、样品的分析1. 基线的采集和停止：测试样品前必须先平衡仪器，走稳仪器。点击Chromeleon Console工具栏的“监视基线”，在弹出的“选择监视通道”窗口勾选所需的监视波长和通道，待基线平稳后（约2030min），再次点击工具栏的“监视基线”立即停止采集。2. 自动进样器进样：在仪器状态栏“新建”右边点击“开始”进行样品分析。3. 手动进样阀进样：单击“开始”，将手动进样阀反时针扳到头之后，将样品用进样针注入定量环，注入完毕后，将进样阀顺时针搬到头，即开始采集数据。七、数据报告的打印 在数据解决界面，右击已完毕分析的样品，选择“导出”，在弹出的选项卡中依次选择报告模板途径和导出文献格式，点击拟定即可。八、关机1. 使用完毕后，按规定用适当的溶剂冲洗色谱柱、系统管路、自动进样器、进样针和柱塞杆密封垫。2. 智能关机：在序列的最后一个样品栏可以选择设立一个空白样品，并在“仪器方法”项下选择相应的洗柱方法，然后在仪器控制界面点击“队列”，在“在运营队列之后”项下选择“保持仪器关机”即可。九、仪器设备的维护和保养1. 色谱柱平常维护（1） 长期不使用HPLC，应当将色谱柱从系统拆除，拆除前应当充足平衡色谱柱，一般用甲醇或乙腈冲洗色谱柱40分钟以上。（2） 每次开机时，流速和柱压要逐渐加强，突增压力会使柱压受到冲击引起紊乱，产生空隙，使柱头凹陷。（3） 在注射样品前要使色谱系统平衡。若色谱柱长期保存未使用，则刚装入HPLC系统时应以流量0.2mL/min平衡过夜（注意断开检测器避免不必要的检测器耗损），然后再以0.8mL/min流量平衡30分钟以上。以低流量缓慢的提高流速直到获得稳定的基线，这样可以保证色谱柱的使用寿命。当然在分析结束时冲洗色谱柱及系统后停止流量时也应当从高流量逐步过渡到低流量直到流量为0。（4） 不要把柱头拧得太紧，过紧易损坏接头螺纹引起渗漏。拧螺丝时使用的搬手应短些，不宜太长。不要把柱子放在有气流的地方或直接放在阳光下，气流和阳光都会使柱子产生温度梯度，导致基线漂移。若怀疑基线漂移是由温度梯度导致的，可设法使柱子绝热，例如用恒温炉或恒湿水套使之恒温，也可用布或毛巾把柱子和接头包起来。（5） 若仪器用来常规分析，可配制一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。（6） 若所注样品会污染柱子，可用适当的溶剂（几百毫升）慢慢冲柱子过夜。使用时再用流动相重新平衡柱子30分钟。（7） 装卸、更换、贮存需挪动柱子时，动作宜轻，不使其受到碰撞，以免柱床因震动而产生空隙或通道。（8） 使用硅胶为基底的柱子，流动相的pH值一般不应8或2，pH8会使硅胶骨架溶解；pH2则键合相化学键易剥离。（9） 色谱柱在使用过程中，柱压逐步升高，也许有两个因素：柱子被污染或有固体析出导致流路堵塞，固定相颗粒被碎或骨架被溶解。解决的办法：在分析柱前加一根短保洗柱（内径450mm），里面的填料应与分析柱相同；避免使用碱性强的流动相；假如柱头部分被污染，可将柱头部分变色的固定相刮去，另加一些新的作为补充。（10） 含盐流动相的冲洗方法：天天操作结束后，先用纯化水或含甲醇5%（最高浓度在20%以下）的水冲洗时间约2030分钟，再用高浓度甲醇（含甲醇85%以上）溶液冲洗约3060分钟（注：不能直接用有机溶液冲洗，盐类易析出，堵塞色谱柱，导致色谱柱永久性损坏；所用水最佳是重蒸馏的水，必须抽滤和脱气）。（11） 不含盐的流动相冲洗方法：天天操作结束后，先用流动相冲洗约1015分钟，再用含5%甲醇的水冲洗1020分钟，最后用高浓度甲醇（含甲醇85%以上）溶液或纯甲醇冲洗，时间约2030分钟（注：不能直接用纯水冲洗，易导致流动停止）。2. Ultimate 3000分离单元的维护（1） 流动相使用不要超过两天，特别是夏天，最佳天天新鲜配制以免微生物的生长。（2） 腐蚀性溶剂或缓冲液在泵内存放不可过夜，否则溶剂会对泵起腐蚀作用。使用腐蚀性物质后要冲洗，先用水后用甲醇。（3） 系统短期不使用，应当在每次使用后冲洗系统30分钟以上。3. 检测器的维护（1） 异常峰和噪音：对于异常峰和方形峰以及噪声异常增大现象，表达光源灯已到极限，应更换并检查上述现象是否消失。若流动相被污染，也会出现异常峰和方形峰的情况。流动相内混有气泡可出现流动池内有气泡的现象，气泡去除方法：一面由泵送液。一面用手指紧压流动池出口的连接管，使池内增压，如此反复34次，气泡即可冲走。注意不应使流动池压力增长太多，以免破裂。流动池漏液或池出口反压过大，环境温度起落大（如直接有风吹在示差折光检测器上），都也许发生流动池漏液，池出口反压过大及温差大的现象。若流动池出口反压太大，可检查流路是事畅通，或更换内径粗一些的出口连接管。（2） 基线漂移：样品池、参比池被污染，可用溶剂清洗检测池，但所用溶液和本来使用的流动互相溶，或采用溶剂过度的方式。若池子太脏，可用5%HNO3和蒸馏水清洗。此外，色谱柱污染，不断有杂质从柱上洗下，也会引起检测器讯号的噪音和漂移。环境温度变化也会引起漂移。十、 相关记录记录好设备使用及平常维修、保养记录。