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生物化学和分子生物学人卫DNA合成省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx
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1、 作者:齐炜炜 高国全单位:中山大学中山医学院第十二章 DNA合成第1页目录第一节 DNA复制基本规律第二节 DNA复制酶学和拓扑学第三节 原核生物DNA复制过程第四节 真核生物DNA复制过程第五节 逆转录第2页重点难点熟悉了解掌握掌握DNA复制体系组成、半保留复制特点及其意义;掌握DNA复制基本规律,DNA聚合酶类型及功效特点DNA复制过程,原核DNA复制与真核DNA复制主要区分;真核生物DNA端粒及端粒酶非染色体DNA复制其它形式;了解逆转录发觉发展了中心法则第3页DNA复制基本规律The basic law of DNA replication第一节第4页DNA复制主要特征:半保留复制(
2、semi-conservativereplication)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)第5页在复制时,亲代双链DNA解开为两股单链,各自作为模板,依据碱基配对规律,合成序列互补子链DNA双链一、DNA以半保留方式进行复制半保留复制概念:第6页子链继承母链遗传信息几个可能方式:全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 第7页密度梯度试验:含含15N-DNA细菌细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代第8页依据半保留复制方
3、式,子代DNA中保留了亲代全部遗传信息,亲代与子代DNA之间碱基序列高度一致遗传保守性,是物种稳定性分子基础,但不是绝正确半保留复制意义:第9页TCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGAGGTACTGTCCATGACAGGTACTGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGG+母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成复制叉复制叉子代子代DNA第10页二、DNA复制从起始点双向进行原核生物基因组是环状DNA,只有一个复制起点(origin)。复制从起点开始
4、,向两个方向进行解链,进行是单点起始双向复制复制中放射自显影图象复制中放射自显影图象第11页A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中两个复制叉C.复制靠近终止点(termination,ter)oriterA B C第12页真核生物每个染色体又有多个起点,呈多起点双向复制特征。每个起点产生两个移动方向相反复制叉,复制完成时,复制叉相遇并汇合连接。从一个DNA复制起点起始DNA复制区域称为复制子(replicon)。复制子是含有一个复制起点独立完成复制功效单位53oriorioriori53第13页53oriorioriori535533553复制复制3第14页三、DNA复制以半不连续方式进行3
5、 5 3 5 解链方向解链方向35335领头链领头链(leading strand)后随链后随链(lagging strand)第15页沿着解链方向生成子链DNA合成是连续进行,这股链称为前导链(leadingstrand)另一股链因为复制方向与解链方向相反,不能连续延长,只能伴随模板链解开,逐段地从53生成引物并复制子链。模板被打开一段,起始合成一段子链;再打开一段,再起始合成另一段子链,这一不连续复制链称为后随链(laggingstrand)沿着后随链模板链合成新DNA片段被命名为冈崎片段(Okazakifragment)第16页四、DNA复制含有高保真性“半保留复制”确保亲代和子代DNA
6、分子之间信息传递绝对保真性高保真度DNA聚合酶利用严格碱基配对标准是确保复制保真性机制之一;体内复制叉复杂结构提升了复制准确性;DNA聚合酶核酸外切酶活性和校读功效以及复制后修复系统对错配加以纠正第17页DNA复制酶学和拓扑学Enzymology and topology of DNA replication第二节第18页参加DNA复制物质:底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNADNA聚合酶,简写为DNA-pol模板(template):解开成单链DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP能够依次聚合其它酶和
7、蛋白质因子第19页(dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi第20页一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间聚合全称:依赖DNADNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称:DNA-pol活性:1.53聚合活性2.核酸外切酶活性第21页核酸外切酶活性:5 A G C T T C A G G A T A 3|3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5?35外切酶活性:能识别错配碱基对,并将其水解53外切酶活性:能切除突变DNA片段第22页(一)原核生物有3种DNA聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 第23页DNA-pol
8、 DNA-pol DNA-pol 分子量(kD)109120250组成单肽链?多亚基不对称二聚体分子数/细胞400?2053核酸外切酶活性有无无基因突变后致死性可能不可能可能原核生物DNA聚合酶第24页个关键酶1个-复合物(、6种亚基)1对-亚基(可滑动DNA夹子)全酶结构包含:DNA聚合酶全酶结构:第25页 亚基(130 000)主要功效是合成DNA 亚基含有35 外切酶活性(复制保真性所必需)亚基可增强其活性 亚基可能起组装作用关键酶由、和 亚基组成:两侧亚基发挥夹稳DNA模板链,并使酶沿模板滑动作用第26页2个-亚基分别和1个关键酶相互作用,其柔性连接区能够确保在复制叉1个全酶分子2个关
9、键酶能够相对独立运动,分别负责合成前导链和后随链功效:有促进全酶组装至模板上及增强关键酶活性作用 -复合物由6种亚基组成:、第27页对复制中错误进行校读,对复制和修复中出现空隙进行填补功效:DNA-pol (109kD):第28页323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是试验室合成片段是试验室合成DNA,进行,进行分子生物学研究中惯用工具酶分子生物学研究中惯用工具酶 第29页DNA-
10、pol(120kD):DNA-pol II基因发生突变,细菌依然能存活DNA-pol 对模板特异性不高,即使在已发生损伤DNA模板上,它也能催化核苷酸聚合。所以认为,它参加DNA损伤应急状态修复第30页(一)常见真核细胞DNA聚合酶有5种DNA-pol 起始引发,有引物酶活性DNA-pol 参加低保真度复制 DNA-pol 在线粒体DNA复制中起催化作用DNA-pol 合成后随链DNA-pol 合成前导链第31页E.Coli真核细胞 功效填补复制中DNA空隙,DNA修复和重组复制中校对,DNA修复 DNA修复 线粒体DNA合成 前导链合成DnaG 引物酶 后随链合成真核生物和原核生物DNA聚合
11、酶比较第32页DNA-pol 分子量(kD)16.54.014.012.525.553聚合活性中?高高高35核酸外切酶活性-+功效起始引发,引物酶活性低保真度复制线粒体DNA复制合成后随链合成前导链真核生物DNA聚合酶第33页二、DNA聚合酶碱基选择和校对功效DNA复制保真性最少要依赖三种机制:恪守严格碱基配对规律聚合酶在复制延长时对碱基选择功效复制犯错时有即时校对功效第34页(一)复制保真性依赖正确碱基选择利用“错配”试验发觉,DNA pol 对核苷酸参入(incorporation)含有选择功效DNA pol 对不一样构型糖苷键表现不一样亲和力,所以实现其选择功效 第35页(二)聚合酶中核
12、酸外切酶活性在复制中识别切除错配碱基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链末端把核苷酸依次水解出来酶,外切酶是有方向性 A:DNA-pol外切酶活性切除错配碱基;并用其聚合活性掺入正确配正确底物B:碱基配对正确,DNA-pol不表现活性DNA pol 校读功效第36页三、复制中DNA 分子拓扑学改变DNA分子碱基埋在双螺旋内部,只有把DNA解成单链,它才能起模板作用。第37页蛋白质(基因)通用名功能DnaA(dnaA)识别复制起始点DnaB(dnaB)解旋酶解开DNA双链DnaC(dnaC)运输和协同DnaBDnaG(dnaG)引发酶催化RNA引物生成SSB单链结合蛋白/
13、DNA结合蛋白稳定已解开单链DNA拓扑异构酶拓扑异构酶又称促旋酶解开超螺旋原核生物复制中参加DNA解链相关蛋白质(一)各种酶参加DNA解链和稳定单链状态第38页解螺旋酶(helicase)利用ATP供能,作用于氢键,使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)复制起始时催化生成RNA引物酶单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链完整第39页解链过程中正超螺旋形成第40页复制过程正超螺旋形成:ABCDNA只固定一端DNA两端固定解开10个碱基对(一个螺旋)DNA将会旋转一圈DNA形成一个超螺旋解开1
14、0个碱基对(一个螺旋)蛋白分子DNA负超螺旋开口易化正超螺旋开口受阻第41页拓扑异构酶作用特点:既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶分类及作用机制:拓扑异构酶:切断DNA双链中一股链,使DNA解链旋转不致打结;适当 时候封闭切口,DNA变为松弛状态。反应不需ATP 拓扑异构酶:切断DNA分子两股链,断端经过切口旋转使超螺旋松弛 利用ATP供能,连接断端,DNA分子进入负超螺旋状态第42页拓扑酶作用方式:第43页四、DNA连接酶连接复制中产生单链缺口连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端,使二者生成磷酸二酯键,从而把两段相邻DNA链连接成一条完整链DNA连接酶(DNA ligase)
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