生物化学和分子生物学人卫DNA合成省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

作者:齐炜炜 高国全单位:中山大学中山医学院第十二章 DNA合成第1页目录第一节 DNA复制基本规律第二节 DNA复制酶学和拓扑学第三节 原核生物DNA复制过程第四节 真核生物DNA复制过程第五节 逆转录第2页重点难点熟悉了解掌握掌握DNA复制体系组成、半保留复制特点及其意义；掌握DNA复制基本规律，DNA聚合酶类型及功效特点DNA复制过程，原核DNA复制与真核DNA复制主要区分；真核生物DNA端粒及端粒酶非染色体DNA复制其它形式；了解逆转录发觉发展了中心法则第3页DNA复制基本规律The basic law of DNA replication第一节第4页DNA复制主要特征:半保留复制(semi-conservativereplication)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)第5页在复制时，亲代双链DNA解开为两股单链，各自作为模板，依据碱基配对规律，合成序列互补子链DNA双链一、DNA以半保留方式进行复制半保留复制概念:第6页子链继承母链遗传信息几个可能方式:全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 第7页密度梯度试验:含含15N-DNA细菌细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代第8页依据半保留复制方式，子代DNA中保留了亲代全部遗传信息，亲代与子代DNA之间碱基序列高度一致遗传保守性，是物种稳定性分子基础，但不是绝正确半保留复制意义:第9页TCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGAGGTACTGTCCATGACAGGTACTGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGG+母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成复制叉复制叉子代子代DNA第10页二、DNA复制从起始点双向进行原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行是单点起始双向复制复制中放射自显影图象复制中放射自显影图象第11页A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中两个复制叉C.复制靠近终止点(termination,ter)oriterA B C第12页真核生物每个染色体又有多个起点，呈多起点双向复制特征。每个起点产生两个移动方向相反复制叉，复制完成时，复制叉相遇并汇合连接。从一个DNA复制起点起始DNA复制区域称为复制子（replicon）。复制子是含有一个复制起点独立完成复制功效单位53oriorioriori53第13页53oriorioriori535533553复制复制3第14页三、DNA复制以半不连续方式进行3 5 3 5 解链方向解链方向35335领头链领头链(leading strand)后随链后随链(lagging strand)第15页沿着解链方向生成子链DNA合成是连续进行，这股链称为前导链（leadingstrand）另一股链因为复制方向与解链方向相反，不能连续延长，只能伴随模板链解开，逐段地从53生成引物并复制子链。模板被打开一段，起始合成一段子链；再打开一段，再起始合成另一段子链，这一不连续复制链称为后随链（laggingstrand）沿着后随链模板链合成新DNA片段被命名为冈崎片段（Okazakifragment）第16页四、DNA复制含有高保真性“半保留复制”确保亲代和子代DNA分子之间信息传递绝对保真性高保真度DNA聚合酶利用严格碱基配对标准是确保复制保真性机制之一；体内复制叉复杂结构提升了复制准确性；DNA聚合酶核酸外切酶活性和校读功效以及复制后修复系统对错配加以纠正第17页DNA复制酶学和拓扑学Enzymology and topology of DNA replication第二节第18页参加DNA复制物质:底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNADNA聚合酶，简写为DNA-pol模板(template):解开成单链DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP能够依次聚合其它酶和蛋白质因子第19页(dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi第20页一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间聚合全称：依赖DNADNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.53聚合活性2.核酸外切酶活性第21页核酸外切酶活性:5 A G C T T C A G G A T A 3|3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5?35外切酶活性:能识别错配碱基对，并将其水解53外切酶活性:能切除突变DNA片段第22页（一）原核生物有3种DNA聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 第23页DNA-pol DNA-pol DNA-pol 分子量（kD）109120250组成单肽链？多亚基不对称二聚体分子数/细胞400？2053核酸外切酶活性有无无基因突变后致死性可能不可能可能原核生物DNA聚合酶第24页个关键酶1个-复合物（、6种亚基）1对-亚基（可滑动DNA夹子）全酶结构包含：DNA聚合酶全酶结构:第25页 亚基（130 000）主要功效是合成DNA 亚基含有35 外切酶活性（复制保真性所必需）亚基可增强其活性 亚基可能起组装作用关键酶由、和 亚基组成：两侧亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动作用第26页2个-亚基分别和1个关键酶相互作用，其柔性连接区能够确保在复制叉1个全酶分子2个关键酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链功效：有促进全酶组装至模板上及增强关键酶活性作用 -复合物由6种亚基组成：、第27页对复制中错误进行校读，对复制和修复中出现空隙进行填补功效：DNA-pol （109kD）:第28页323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是试验室合成片段是试验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中惯用工具酶分子生物学研究中惯用工具酶 第29页DNA-pol（120kD）:DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活DNA-pol 对模板特异性不高，即使在已发生损伤DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。所以认为，它参加DNA损伤应急状态修复第30页（一）常见真核细胞DNA聚合酶有5种DNA-pol 起始引发，有引物酶活性DNA-pol 参加低保真度复制 DNA-pol 在线粒体DNA复制中起催化作用DNA-pol 合成后随链DNA-pol 合成前导链第31页E.Coli真核细胞 功效填补复制中DNA空隙，DNA修复和重组复制中校对，DNA修复 DNA修复 线粒体DNA合成 前导链合成DnaG 引物酶 后随链合成真核生物和原核生物DNA聚合酶比较第32页DNA-pol 分子量（kD）16.54.014.012.525.553聚合活性中？高高高35核酸外切酶活性-+功效起始引发，引物酶活性低保真度复制线粒体DNA复制合成后随链合成前导链真核生物DNA聚合酶第33页二、DNA聚合酶碱基选择和校对功效DNA复制保真性最少要依赖三种机制:恪守严格碱基配对规律聚合酶在复制延长时对碱基选择功效复制犯错时有即时校对功效第34页（一）复制保真性依赖正确碱基选择利用“错配”试验发觉，DNA pol 对核苷酸参入（incorporation）含有选择功效DNA pol 对不一样构型糖苷键表现不一样亲和力，所以实现其选择功效 第35页（二）聚合酶中核酸外切酶活性在复制中识别切除错配碱基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链末端把核苷酸依次水解出来酶，外切酶是有方向性 A：DNA-pol外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配正确底物B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性DNA pol 校读功效第36页三、复制中DNA 分子拓扑学改变DNA分子碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。第37页蛋白质（基因）通用名功能DnaA（dnaA）识别复制起始点DnaB（dnaB）解旋酶解开DNA双链DnaC（dnaC）运输和协同DnaBDnaG（dnaG）引发酶催化RNA引物生成SSB单链结合蛋白/DNA结合蛋白稳定已解开单链DNA拓扑异构酶拓扑异构酶又称促旋酶解开超螺旋原核生物复制中参加DNA解链相关蛋白质（一）各种酶参加DNA解链和稳定单链状态第38页解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)复制起始时催化生成RNA引物酶单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链完整第39页解链过程中正超螺旋形成第40页复制过程正超螺旋形成：ABCDNA只固定一端DNA两端固定解开10个碱基对（一个螺旋）DNA将会旋转一圈DNA形成一个超螺旋解开10个碱基对（一个螺旋）蛋白分子DNA负超螺旋开口易化正超螺旋开口受阻第41页拓扑异构酶作用特点:既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶分类及作用机制：拓扑异构酶：切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当 时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP 拓扑异构酶：切断DNA分子两股链，断端经过切口旋转使超螺旋松弛 利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态第42页拓扑酶作用方式：第43页四、DNA连接酶连接复制中产生单链缺口连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻DNA链连接成一条完整链DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：第44页DNA连接酶作用：第45页功效:DNA连接酶在复制中起最终接合缺口作用在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用也是基因工程主要工具酶之一第46页DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成比较提供核糖3-OH提供5-P结果DNA聚合酶引物或延长中新链游离dNTP去PPi(dNTP)n+1连接酶复制中不连续两条单链不连续连续链拓扑酶切断、整理后两链改变拓扑状态第47页原核生物DNA复制过程DNA replication in prokaryotes第三节第48页起始是复制中较为复杂步骤，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物 需要处理两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端一、复制起始第49页原核生物复制起始部位及解链原核生物复制起始部位及解链（此图有误需修改）（此图错误部分包含文字和少了一个9bp重复序列已在图中标注，请编辑帮忙修改）第50页 Dna A Dna B、Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5（二）引物合成和起始复合物形成含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域复合结构称为起始复合物第51页起始复合物和复制叉生成第52页3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成短链RNA分子引物引物3 HO5引物引物酶酶第53页二、DNA链延长复制延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP方式逐一加入引物或延长中子链上，其化学本质是磷酸二酯键不停生成 第54页 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol第55页领头链合成：领头链子链沿着5 3 方向能够连续地延长第56页后随链合成第57页 在复制叉同时合成前导链和后随链在复制叉同时合成前导链和后随链第58页第59页原核生物基因是环状DNA，双向复制复制片段在复制终止点(ter)处汇合oriter E.coli8232 ori terSV40500三、复制终止第60页5 5 5 DNA-pol OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶子链中RNA引物被取代第61页第62页真核生物DNA复制过程Eukaryotic DNA replication process第四节第63页真核生物与原核生物DNA复制差异：真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶转换切除冈崎片段RNA引物是核酸酶RNAseH和FEN1等第64页哺乳动物细胞周期DNA合成期G1G2SM细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M调整，与蛋白激酶活性相关 蛋白激酶经过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用 第65页真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同时开启 复制起始需要DNA-pol（引物酶活性）、pol 和pol 参加。还需解螺旋酶活性、拓扑酶和复制因子(replication factor,RF)一、真核生物复制起始与原核基本相同第66页酵母复制起点为自主复制序列（autonomously replicating sequences，ARS）：酵母染色体含有多个复制起点。元件A(富含A/T共有序列)：结合一个特异蛋白质复合物复制起点识别复合物(ORC)3个序列(B1、B2和B3)能够增加复制起点效率，其中B29个碱基与上述ARS共有序列相同酵母复制起始点第67页拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶轻易解旋），去除复制叉前方产生正超螺旋Tol和TolDNA双螺旋解链，参加组装引发体DNA解旋酶连接冈崎片段DNA连接酶核酸酶，切除RNA引物RNAse H核酸酶，切除RNA引物FEN1DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复Pol /合成RNA-DNA引物Pol /引发酶有依赖DNAATPase活性，结合于引物-模板链，激活DNA聚合酶，促使PCNA结合于引物-模板链RFC激活DNA聚合酶和RFCATPase活性PCNA单链DNA结合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶轻易结合DNARPA功 能蛋白质真核DNA复制叉主要蛋白质功效第68页现在认为pol 主要催化合成引物，然后快速被含有连续合成能力DNA pol 和DNA pol 所替换，这一过程称为聚合酶转换。DNA pol 负责合成后随链，DNA pol 负责合成前导链。二、真核生物复制延长发生DNA聚合酶转换第69页前导链：出现在引发后期后随链：发生于每个冈崎片段合成之际发生DNA聚合酶转换原因是Pol 不具备连续合成能力DNA聚合酶转换关键蛋白是RFCDNA聚合酶/转换第70页真核DNA聚合酶转换和后随链合成第71页3 5 5 3 前导链前导链3 5 3 5 亲代亲代DNA后随链后随链引物引物核小体核小体三、真核生物DNA合成后马上组装成核小体第72页染色体DNA呈线状，复制在末端停顿复制中冈崎片段连接，复制子之间连接染色体两端DNA子链上最终复制RNA引物，去除后留下空隙四、端粒酶参加处理染色体末端复制问题第73页切除引物两种机制第74页线性DNA复制一次端粒缩短 第75页5 3 3 5 5 3 3 5+5 3 3 3 3 5 5 第76页端粒（telomeres）由富含TG重复序列组成人端粒重复序列为5-(TnGn)x-3 这些重复序列多为双链，但每个染色体3端比5 端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可处理染色体末端复制问题第77页组成：端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)端粒酶(telomerase)第78页端粒酶（telomerase）是一个核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白质组成端粒酶以自己RNA组分作为模板，以染色体3端ssDNA（后随链模板）为引物，将端粒序列添加于染色体3端。这些新合成DNA为单链第79页端粒酶催化作用爬行和端粒延长过程 第80页真核全部染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期S期，而且只能复制一次五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次第81页前复制复合物在G1期形成而在S期被激活真核细胞DNA复制起始分两步进行，即复制基因选择和复制起点激活复制基因（replicator）是指DNA复制起始所必需全部DNA序列第82页ORC最少募集两种解旋酶加载蛋白Cdc6和Cdt1复制起点识别复合物（originrecognition complex，ORC）识别并结合复制基因三种蛋白质一起募集真核细胞解旋酶Mcm2-7前复制复合物（pre-RC）形成第83页pre-RC激活和激活和组装真核组装真核DNA复制叉复制叉第84页激活pre-RC，以起始DNA复制抑制形成新pre-RCCDK控制pre-RC形成和激活真核细胞经过依赖细胞周期蛋白蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）严格控制pre-RC形成和激活Cdk功效：第85页D-环复制（D-loop replication）是线粒体DNA复制形式六、真核生物线粒体DNA按D环方式复制dNTPDNA-pol 第86页逆转录reverse transcription第五节第87页逆转录酶(reverse transcriptase)逆转录(reverse transcription)逆转录酶一、逆转录病毒基因组RNA以逆转录机制复制RNARNADNADNA第88页逆转录病毒细胞内逆转录现象:RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA第89页RNA病毒在细胞内复制成双链DNA前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在 一 些 情 况 下，前 病 毒 基 因 组 经 过 基 因 重 组(recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表示。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病原因 第90页逆转录酶催化cDNA合成 第91页分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目标基因主要方法之一，此法称为cDNA法 以mRNA为模板，经逆转录合成与mRNA碱基序列互补DNA链 n试管内合成cDNA:cDNA complementary DNA 逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T第92页逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中重大发觉 逆转录现象说明：最少在一些生物，RNA一样兼有遗传信息传代与表示功效对逆转录病毒研究，拓宽了20世纪初已注意到病毒致癌理论 二、逆转录发觉发展了中心法则第93页本章小结1、DNA复制基本特点2、原核生物复制过程包含起始、延长和终止（1）起始是将DNA双链解开形成复制叉（2）复制延长由引物或延长中子链提供3-OH，供dNTP掺入生成磷酸二酯键，延长中子链有前导链和后随链之分，复制产生不连续片段称为冈崎片段（3）复制终止需要去除RNA引物、填补留下空隙并连接片段之间缺口使成为连续子链第94页本章小结3、真核生物复制发生于细胞周期S期，其过程与原核生物相同，但更为复杂和精巧。复制延长和核小体组蛋白分离和重新组装相关。复制终止需要端粒酶延伸端粒DNA4、非染色体基因组采取特殊方式进行复制第95页本章知识点框架图：DNA复制原核生物复制真核生物复制起始：DNA解链；引物合成和引发体形成延长：复制延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP方式逐一加入引物或延长中子链上，其化学本质是磷酸二酯键不停生成 终止：双向复制复制片段在终止点处汇合起始：与原核生物基本相同延长：DNA聚合酶转换；核小体组蛋白分离和重新组装终止：需要端粒酶延伸端粒DNA第96页谢 谢 观 看第97页