SNP及检测关键技术专业资料.doc
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1、1定义:单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),重要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起DNA序列多态性。它是人类可遗传变异中最常用一种。占所有已知多态性90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每5001000个碱基对中就有1个,预计其总数可达300万个甚至更多。SNP所体现多态性只涉及到单个碱基变异,这种变异可由单个碱基转换(transition)或颠换(transversion)所引起,也可由碱基插入或缺失所致。但普通所说SNP并不涉及后两种状况。单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组上单个核苷酸变异,涉及置换、颠换、缺失和插入。所谓
2、转换是指同型碱基之间转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间替代;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间替代。从理论上来看每一种SNP 位点都可以有4 种不同变异形式,但事实上发生只有两种,即转换和颠换,两者之比为2:1。SNP 在CG序列上浮现最为频繁,并且多是C转换为T ,因素是CG中C 常为甲基化,自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。普通而言,SNP 是指变异频率不不大于1 %单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一种SNP ,人类基因组上SNP 总量大概是3 106 个。根据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替代状况,即A/
3、G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换发生频率占多数,并且是C2T 转换为主,其因素是Cp GC 是甲基化,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T ,Cp G 也因而变为突变热点。理论上讲,SNP既也许是二等位多态性,也也许是3个或4个等位多态性,但事实上,后两者非常少见,几乎可以忽视。因而,普通所说SNP都是二等位多态性。这种变异也许是转换(C T,在其互补链上则为G A),也也许是颠换(C A,G T,C G,A T)。转换发生率总是明显高于其他几种变异,具备转换型变异SNP约占2/3,其他几种变异发生几率相似。Wang等研究也证明了这一点。转换几率高,也许是由于C
4、pG二核苷酸上胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变位点,其中大多数是甲基化,可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。SNP 在动物基因组中分布广泛,每一种核苷酸发生突变概率大概为10 - 9 。由于选取压力,SNP在单个基因、整个基因组中以及种群间分布是不均匀。SNP 在非编码区中要多于编码区,并且在编码区也是非同义突变(有氨基酸序列变化) 频率比其她方式突变频率低得多4 。而基因间,同一种基因中编码SNP (coding SNP ,cSNP) 数目也不相似,可从029 个不等。多项研究同步发现不同种族间SNPs 数目也是不同,非洲人群及非裔种族中SNPs 数量最多,而其她种群SNPs 要少得多,因而
5、通过比较亚群间等位基因频率将有助于阐明种族构造和进化。在基因组DNA中,任何碱基均有也许发生变异,因而SNP既有也许在基因序列内,也有也许在基因以外非编码序列上。总来说,位于编码区内SNP(coding SNP,cSNP)比较少,由于在外显子内,其变异率仅及周边序列1/5.但它在遗传性疾病研究中却具备重要意义,因而cSNP研究更受关注。从对生物遗传性状影响上来看,cSNP又可分为2种:一种是同义cSNP(synonymous cSNP),即SNP所致编码序列变化并不影响其所翻译蛋白质氨基酸序列,突变碱基与未突变碱基含义相似;另一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP),指碱
6、基序列变化可使以其为蓝本翻译蛋白质序列发生变化,从而影响了蛋白质功能。这种变化常是导致生物性状变化直接因素。cSNP中约有一半为非同义cSNP。先形成SNP在人群中常有更高频率,后形成SNP所占比率较低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在,其所占比率也不尽相似,但大概有85%应是共通。2.SNP自身特性:1)SNP数量多,分布广泛。据预计,人类基因组中每1000个核苷酸就有一种SNP,人类30亿碱基中共有300万以上SNPs.SNP 遍及于整个人类基因组中,依照SNP在基因中位置,可分为基因编码区SNPs(Coding-region SNPs,cSNPs)、基因周边SNPs(Perige
7、nic SNPs,pSNPs)以及基因间SNPs(Intergenic SNPs,iSNPs)等三类。2) SNP适于迅速、规模化筛查。构成DNA碱基虽然有4种,但SNP普通只有两种碱基构成,因此它是一种二态标记,即二等位基因(biallelic)。 由于SNP二态性,非此即彼,在基因组筛选中SNPs往往只需+/-分析,而不用分析片段长度,这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。3) SNP等位基因频率容易预计。采用混和样本估算等位基因频率是种高效迅速方略。该方略原理是:一方面选取参照样本制作原则曲线,然后将待测混和样本与原则曲线进行比较,依照所得信号比例拟定混和样本中各种等位基因频率。4)
8、 易于基因分型。SNPs 二态性,也有助于对其进行基因分型。对SNP进行基因分型涉及三方面内容:(1)鉴别基因型所采用化学反映,惯用技术手段涉及:DNA分子杂交、引物延伸、等位基因特异寡核苷酸连接反映、侧翼探针切割反映以及基于这些办法变通技术;(2)完毕这些化学反映所采用模式,涉及液相反映、固相支持物上进行反映以及两者皆有反映。(3)化学反映结束后,需要应用生物技术系统检测反映成果。绝大多数疾病发生与环境因素和遗传因素综合伙用关于,普通以为是在个体具备遗传易感性基本上,环境有害因素作用而导致疾病。不同群体和个体对疾病易感性、抵抗性以及其她生物学性状(如对药物反映性等)有差别,其遗传学基本是人类
9、基因组DNA 序列变异性, 其中最常用是SNP.易感基因特点是基因变异自身并不直接导致疾病发生,而只导致机体患病潜在危险性增长,一旦外界有害因素介入, 即可导致疾病发生。此外在药物治疗中,易感基因变异导致药物对机体疗效和副作用不同。随着人类基因组筹划进展,人们愈来愈相信基因组中SNP 有助于解释个体表型差别、不同群体和个体对疾病,特别是对复杂疾病易感性以及对各种药物耐受性和对环境因子反映。因而, 寻找和研究SNP 已成为人类基因组筹划内容和目的之一。多态性与突变区别1、多态性是一种群体概念,多态性指这个差别占群体1%以上。否则就叫突变(不大于1%)2、SNP是多态性中一种,只是进一步限定了差别
10、只是单碱基。3、SNP普通来说,是所有体细胞同样基因型(除开嵌合体)。4、突变普通不是一种个体所有细胞变化。5、如果突变发生在生殖细胞,则可以遗传,但是只要这个突变群没有达到总群体1%,它就只是一种突变株/系。达到了1%就是多态性了。惯用数据库:Human Gene Mutation Database (HGMD) / / The Genome Database (GD) / /Database of Single Nuleotide Polymorphisms (dbSNP) / /Human Genome Variation Database (HGVbase) / /The Snp Co
11、nsortium, LTD.(TSC) / /.org3.SNP既有检测技术人们对SNP 研究办法进行了许多摸索和改进。SNP 分析技术按其研究对象重要分为两大类,即:对未知SNP 进行分析,即找寻未知SNP 或拟定某一未知SNP 与某遗传病关系。检测未知SNP 有许各种办法可以使用,如温度梯度凝胶电泳( TGGE) 、变性梯度凝胶电泳(DGGE) 、单链构象多态性(SSCP) 、变性高效液相色谱检测(DHPLC) 、限制性片段长度多态性(RFL P) 、随机扩增多态性DNA(RAPD) 等,但这些办法只能发现具有SNP DNA 链,不能确知突变位置和碱基类别,要想做到这一点,必要对那些具有S
12、NP DNA 链进行测序。对已知SNP 进行分析,即对不同群体SNP遗传多样性检测或在临床上对已知致病基因遗传病进行基因诊断。筛查已知SNP 办法有等位基因特异寡核苷酸片段分析(ASO) 、突变错配扩增检查(MAMA) 、基因芯片技术(gene chips) 等。由于人类基因工程带动,许多物种都已开始了基因组项目,并建立了大量数据库,比较这些来自不同实验室不同个体序列,就可以检测到SNP。SNP位点信息已知状况下, 选取SNPGENOTYPING办法,重要依照你经费状况设计,我分别给你分析一下现状:A、普通实验室: 经费普通, 仪器不具备时, 最多用是如下两种办法:1、基于PCR办法,也叫AS
13、-PCR, (ALLELE-SPECIFIC PCR)办法。 重要原理是运用引物在扩增时3端相对高BASE规定,进行设计。这个办法是最便宜, 不需要酶切, 一次PCR就可以得到GENOTYPING信息。缺陷: PCR对于3端特异性在不同退火温度时有出入, 因此退火温度摸索很核心,否则假阳性扩增是很容易。此外, 内参照设立也很重要,这个东西还是很故意思。 并且,所使用引物位置无法人为调节,只能放在SNP5段。2、基于酶切分型。 依托限制性内切酶忠贞性进行单SNP分型。 SNP突变与否, 也许影响某个酶辨认位点存在或消失。 通过酶切产物电泳条带,判断SNP突变状况, 即纯和, 野生纯和,和杂和子。
14、当没有直接可运用酶切位点时,可以采用突变引物中个别BASE,从而凑成切点设计,也叫做RG-PCR, restriction site generation PCR。B、有经费实验室办法:这里我写几种自己曾经涉足过办法,可行性比较强, 但是需要相应经费支持和相应仪器,但是通量相对更高, 效率更好:1、直接测序, 基于PCR产物直接sequencing办法, 比对序列成果, 就可以进行SNP辨认和分析。2、分型质谱, 华大生物信息平台那边可以外接服务, 提供PCR产物即可。3、pyro-sequencing, 微测序, 中科院遗传所 王沥研究员那里有可以联系外接服务。4、D-HPLC, 变性高效液
15、相色谱法。 北京可以去联系做地方不少, 北京大学生科院有机器, 此外北京大学肿瘤研究所也有机器, 国家人类基因组陈标那里也有一台, 需要做话, 拿着经费和她们联系就可以, 这个办法也很不错, 价钱可以商量。5、尚有些办法,如DNA芯片技术适合对于large scale SNP筛查, 普通用于组学领域, 也许不合用与您状况。 尚有许多如荧光共振能量转移等办法/探针杂交法等,并未在本领域中华人民共和国内推广, 就不一一简介了。1)测序 重要发现新SNP位点和比较集中SNP位点,如hla区域,但成本较高,工作量大,不适合大样本做疾病关联分析。2)taqman探针成果比较可靠,国外文章也大量应用,但是
16、对于国内成本偏高,同类尚有snpshot技术,abi和贝克曼都相应试剂盒。成本和成功率都比taqman要低。3)snp芯片国外大规模筛查疾病关联分析惯用,illumina和affy均有不同密度成熟产品,单位点成本很低,但点较多,样本多时也会很高耗费,但成果精确,适合复杂疾病,有实力项目组普通大型机器点在384-群基因组可以订制,但成本会高;illumina开发了一台小芯片,极其适合1-384,可以订制,成本在2-5元/人点,但还没有很成熟流程,详细效果和成功率要进一步看。4)剩余就是老式办法如酶切,PCR-SSCP等,也有杂志接受,但普通需要测序验证。缺陷是工作量太大,成果不精确,不是所有位点
17、都可以做,但成本很低。当前已有各种办法可用于SNP检测,如依照DNA列阵微测序法、动态等位基因特异杂交、寡聚核苷酸特异连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。但不论哪一种办法,一方面必要进行靶序列扩增,然后才干进行其他检测。老式SNP检测办法是采用某些已有成熟技术,如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异寡聚核苷酸杂交(ASO)等。这些技术虽在某种限度上能完毕对SNP检测,但由于它们必要通过凝胶电泳进行检测,因而,距迅速、高效、自动化目的还相差甚远。老式RFLP只能检测到SNP一某些,测序技术既费时费力,又不易实现自动化,并且DNA链二级构造
18、还容易导致人工假相,使测序成果浮现偏差,不适当于SNP检测;SSCP则很难满足自动化需要,难以大规模开展工作。因而,这些办法均未被广泛采用。DNA芯片技术是近年来新开发一种DNA序列变异检测工具。DNA芯片(DNA chip),也称生物芯片(biochip),其大小与计算机上CPU芯片相似,约1 cm2或更大些,以玻璃、硅、聚丙烯等作为载体基片,芯片上铺了一层肉眼看不见DNA纤维“地毯”,即具备特定碱基序列探针。待测基因经提取后,被切成长短不一片段,经荧光化学物质标记后,注射到嵌有芯片载片上。由于DNA和探针杂交限度与荧光强度有关,因而通过激光扫描,即可依照荧光强弱测出被检测序列变异。当前已有
19、多家公司开展了对芯片研究,例如美国Affymetrix公司、NEN生命科学公司等。前者曾开发出BRCA1(乳癌基因1号)芯片、p53芯片等,后者则在1张玻璃芯片上集成了多达2400个已知基因。此外,Research Genetics公司新近开发了1个集成有1500个SNPDNA芯片,它涵盖了人类基因组所有24条染色体,所提供信息量至少等于或优于当前惯用300400个微卫星标记图谱,检测时只需0.5gDNA样品就可进行1次全基因组扫描。此外Transgenomic公司WAVE核苷酸片段分析系统是高通量且较为精确可靠筛查未知、已知SNP新办法。运用Transgenomic公司WAVE核苷酸片段分析
20、系统进行SNP检测平均每个样本费用为$0.5。 4. 当前SNP功能研究重要有如下几方面:SNP 分型技术可分为两个时代,一为凝胶时代,二为高通量时代。凝胶时代重要技术和办法涉及限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)、寡核苷酸连接分析(OLA)、等位基因特异聚合酶链反映分析(AS2PCR)、单链构象多态性分析(SSCP)、变性梯度凝胶电泳分析(DGGE),虽然这些技术与高通量时代技术原理大体同样,但是由于它不能进行自动化,只能进行小规模SNP分型测试,因此必然会被裁减。高通量时代SNP分型技术按其技术原理可分为:特异位点杂交(ASH)、特异位点引物延伸(ASPE)、单碱基延伸(SBCE)、特
21、异位点切割(ASC)和特异位点连接(ASL)5 种办法。此外,采用特殊质谱法和高效液相层析法也可以大规模、迅速检出SNP 或进行SNP 初筛。近年来已经在晶体上用“光刻法”实现原位合成,直接合成高密度可控序列寡核苷酸,使DNA 芯片法显示出强大威力,对SNP 检测可以自动化、批量化,并已在建立SNP 图谱方面投入实际应用。DNA 芯片法有望在半晌之间评价整个人类基因组。1)报告基因转染技术:这一技术重要用于研究启动子SNP对于mRNA转录效率,是通过观测转录结局来判断SNP与否具备功能。2)EMSA技术:通过在体外合成含SNP位点寡核苷酸与转录因子特异性结合,观测结合强度和效率,但是该技术由于
22、只人工合成较短长度寡核苷酸,没有考虑SNP周边遗传背景环境影响,因而在重复性和说服力上不强。3)ChiP技术:该技术通过超声将染色体碎片化,再将碎片化核酸与转录因子结合,最后通过PCR技术观测判断结合效率和强度,该技术克服了EMSA某些缺陷,当前做文献较多。5 SNP产生功能机制研究个人之所见1.对大多数SNP而言,都由于位于某些非编码区域而不产生明显功能性影响,此时做SNP功能意义不大。2.启动子SNP研究是做人最多,有关实验技术都比较成熟,其产生功能机制重要是影响TF与启动子结合能力,从而调控基因转录。3.编码区SNP有同义和非同义2种,非同义突变由于会导致氨基酸变化,从而影响蛋白质功能,
23、特别是发生在构造功能区域SNP特别重要,可是这方面技术还存在瓶颈,做得相称少,据我所知要用什么诱导点突变办法再去评价蛋白质功能。至于非同义突变,虽然没有明显功能分子机制,但是在遗传学上也许由于与附近其他致病基因表达或者SNP连锁,因而在流行病学上形成阳性成果普通以此解释。4.内含子区域SNP产生功能分子机制普通是与附近其他基因SNP连锁或者也许影响mRNA剪接从而影响蛋白质功能诸多研究中做INTRON发既有阳性成果解释不了,并且大多只是猜测。PYRO测序用于SNP基因分型其实是一种段片段焦磷酸测序技术,在测序引物引导下,完毕段片段(含snp)测序,从而实现基因分型。缺陷:不能检测长片段,对于重
24、复序列没有办法。原理简介1.测序引物与单链,PCR扩增DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶,以及底物APS和荧光素一起孵育。2.四种dNTP之一被加入反映体系,如与模扳配对,此dNTP与引物末端形成共价键,dNTP焦磷酸基团(PPi)释放出来。并且释放出来Ppi量与和模板结合dNTP量成正比。3.ATP sulfurylase在adenosine 5 phosphosulfate存在状况下催化PPi形成ATP,ATP驱动luciferase介导Luciferin向oxyluciferin转化,oxyluciferin发出与ATP量成正比可见光信
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