沉淀分离关键技术.doc

第二讲沉淀分离技术2学时、通过本章学习应掌握内容1、什么是沉析？2、沉析法纯化蛋白质长处有哪些？3、沉析普通操作环节是什么？4、何谓盐析？其原理是什么？5、盐析操作时惯用盐是什么？6、影响盐析重要因素有哪些？7、有机溶剂沉析法原理是什么？8、影响有机溶剂沉析重要因素有哪些？9、等电点沉析工作原理是什么？10、其他惯用沉析办法有哪些？一、沉淀分离目及其办法沉淀分离技术是典型化学分离技术。沉淀概念是指溶液中介质在恰当条件下由液相变成固相而析出过程。沉淀技术目涉及两个：通过沉淀使目的成分达到浓缩和去杂质目。当目的成分是以固相形式回收时，固液分离可除去留在溶液中非必要成分；如果目的成分是以液相形式回收时，固液分离可使不必要成分以沉淀形式去除。通过沉淀可使已纯化产品由液态变成固态，有助于保存和进一步加工解决。沉淀分离技术普通涉及下列各种沉淀办法：无机沉淀剂沉淀分离法：普通是以盐类作为沉淀剂一类沉淀办法，如盐析法，多用于各种蛋白质和酶类分离纯化，以及某些金属离子去除。惯用沉淀剂有：硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、氯化纳等。 有机沉淀剂沉淀分离法：以有机溶剂作为沉淀剂一种沉淀分离办法，多用于生物小分子、多糖及核酸类产品分离；有时也用于蛋白质沉淀和金属离子去除；用于酶沉淀分离时，易导致酶失活。惯用到沉淀剂有：丙酮、乙醇、甲醇等。非离子多聚体沉淀剂沉淀分离法：采用非离子型多聚体作为目的成分沉淀剂，合用于生物大分子沉淀分离，如酶、核酸、蛋白质、病毒、细菌等。典型非离子型多聚体是聚乙二醇（PEG），依照其相对分子量大小，有PEG600、PEG4000、PEG0等型号。等电点沉淀法：重要是运用两性电解质在等电点状态下溶解度最低而沉淀析出原理。合用于氨基酸、蛋白质及其他属于两性电解质组分沉淀分离，如大豆蛋白“碱提酸沉”提取办法。共沉淀分离法：又可称为生物盐复合物沉淀法，用于各种化合物特别是某些小分子物质沉淀。它是运用沉淀同步对其他待分离成分吸附共沉淀而达到除杂目。变性沉淀分离法：又称为选取性变性沉淀法，是运用特定条件使目的成分变性，导致其性质变化如溶解度下降而得以分离。合用于某些变性条件下差别较大蛋白质和酶类分离纯化。采用变性条件有pH值、温度变化以及添加剂、运用酶作用等，腐竹生产是运用大豆蛋白热变性而进行分离一种例子。二、沉析特点操作简朴、经济、浓缩倍数高，但针对复杂体系而言，分离度不高、选取性不强。三、沉析操作普通过程1、在通过滤或离心后样品中加入沉析剂；2、沉淀物陈化，增进晶体生长；3、离心或过滤，收集沉淀物；四、无机沉淀剂沉淀分离法 某些金属离子各种盐类形式，如硫酸盐、碳酸盐、草酸盐等，其溶解度都很小。因此，当添加恰当无机沉淀剂形成上述各种化合物时，便会形成沉淀，使金属离子得以分离；此外，大某些蛋白质等生物大分子都可以通过在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程称为“盐析”。这节重点简介盐析法。2.1 盐析法盐析分离法应用最早和最广泛是在蛋白质和酶类分离工作中，用盐析法分离蛋白质已有80近年历史。由于其他分离技术浮现，盐析法在选取性方面显得有些局限性，但是在粗提纯阶段，盐析法至今仍普遍得到应用。2.1.1盐析原理一方面需要理解生物大分子在水溶液中存在状态：（1）两性电解质，由于静电力作用，分子间互相排斥，形成稳定分散系（2）蛋白质周边形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了互相碰撞3、盐析过程当中性盐加入蛋白质分散体系时也许浮现如下两种状况：（1）“盐溶”现象在低盐浓度下，蛋白质和酶类溶解度随着随着盐浓度提高而增大，这个过程称为盐溶。这重要是中性盐离子对蛋白质分子表面活性基团及水活度影响：（a）无机盐离子在蛋白质表面上吸附，使颗粒带相似电荷而互相排斥。（b）无机盐离子增长了蛋白质亲水性，改进了与水膜结合，增长了蛋白质分子与溶剂分子互相作用力，使蛋白质溶解度增长。（2）“盐析”现象高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，因素如下：（a）无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，某些中和了蛋白质电性，使蛋白质分子之间排斥力削弱，从而可以互相靠拢；（b）中性盐亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区互相作用导致沉淀； 在盐析过程中，蛋白质溶解度与溶液中盐离子强度之间关系可用Cohn表达式表达：lg(S/S0) = - KsI或 lgS = lgS0 - KsI式中：S0-蛋白质在纯水中（I=0）溶解度； S-蛋白质在离子强度为I溶液中溶解度；Ks-盐析常数；I -离子强度。其中离子强度I=1/2Mz2，M表达溶液中各种离子物质量浓度，z为各种离子价数。当温度一定期，对于某一溶质来说，其S0也是一常数，即lgS0 = （截距常数），因此有lgS =- KsI。值大小取决于溶质性质，与温度和pH值关于。Ks 取决于盐性质，并且与离子价数、平均半径关于。普通来说，溶质Ks值越大，盐析效果越好；同一溶液中，两种溶质Ks值相差越大，则盐析选取性就越好。表2-1列举了某些蛋白质用不同盐类进行盐析时Ks值。普通来说，高价阴离子如硫酸根、磷酸根等有较高Ks值，而高价阳离子如镁离子、钙离子等，则会有较低Ks值。至于蛋白质性质与Ks值之间关系，当前还没有明显规律可寻，也没有恰当理论加以详述。2.1.2盐析分离中盐选取 在蛋白质盐析中，以硫酸铵、硫酸钠应用最广。虽然磷酸盐盐析效果比硫酸铵好，但硫酸铵最大长处是温度系数小，温度变化引起溶液性质变化不大，且其溶解度大，应用于许多蛋白质和酶盐析时，对蛋白质和酶变性影响较小，并且硫酸铵价格低廉。硫酸铵用于蛋白质盐析时，最大缺陷是除了缓冲能力较小外，还由于含氮，影响蛋白质定量分析，特别是采用凯氏定氮法和双缩脲法进行测定期。硫酸钠由于不含氮，因而不影响蛋白质定量测定，但其缺陷是在30如下溶解度太低，需在30以上操作效果才好，不利于保持酶活性。磷酸盐、柠檬酸钠等也用于蛋白质盐析，但由于溶解度低，或容易与其他金属离子产生沉淀，或因酸性过强，都不如硫酸铵应用那样广泛。4、离子强度对盐析过程影响Cohn经验公式S蛋白质溶解度，mol/L;I离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价盐浓度为0时，蛋白质溶解度对数值。与蛋白质种类、温度、pH值关于，与盐无关；Ks盐析常数，与蛋白质和无机盐种类关于，与温度、pH值无关。Ks盐析法：在一定pH和温度下，变化体系离子强度进行盐析办法；盐析法：在一定离子强度下，变化pH和温度进行盐析；其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因而惯用于提取液前解决。而盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因而辨别率更高，惯用于初步纯化。5、盐析用盐选取在相似离子强度下，盐种类对蛋白质溶解度影响有一定差别，普通规律为：半径小高价离子盐析作用较强，半径大低价离子作用较弱（Ks）磷酸钾硫酸钠硫酸铵柠檬酸钠硫酸镁选用盐析用盐几点考虑：（1）盐析作用要强（2）盐析用盐需有较大溶解度（3）盐析用盐必要是惰性（4）来源丰富、经济6、惯用盐析用盐#硫酸铵：溶解度大（767g/L）硫酸钠磷酸盐柠檬酸盐7、影响盐析因素（1）溶质种类影响：Ks和值（2）溶质浓度影响：蛋白质浓度大，盐用量小，但共沉作用明显，辨别率低；蛋白质浓度小，盐用量大，辨别率高；（4）pH值：影响蛋白质表面净电荷数量，普通调节体系pH值，使其在pI附近；（5）盐析温度：大多数状况下，高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降；蛋白质浓度影响 对溶液中各种蛋白质进行分步分离时，各种蛋白质浓度不同，硫酸铵用量差别也较大。蛋白质浓度高时，盐用量减少。但如果各种蛋白质Ks值比较接近，则会发生比较严重共沉作用，使盐析分离选取性下降。蛋白质浓度过低时，盐用量增大，但共沉作用较小，选取性较好。溶液中蛋白质浓度为2.5%-3.0%时进行盐析，效果比较好。离子强度和离子类型影响 对于同一类蛋白质，随着溶液中离子强度由低而高变化，蛋白质也随之发生由盐溶而至盐析变化过程。对于不同类型蛋白质，盐析时所规定离子强度各有不同。用盐析法分离各种蛋白质时，总是采用低离子强度分离出一种蛋白质，然后再逐渐增长离子强度，分离出第二种、第三种乃至更各种蛋白质，这就是分步盐析法。运用此法时，各种蛋白质Ks值差别越大，效果越好。不同离子类型对盐析效果影响 普通以为离子半径小、带较高电荷离子盐析效果较好；离子半径大，带低电荷离子盐析效果差。如单价盐KCl、NaCl盐析效果就较差。不同离子这种差别，惯用其相应于蛋白质盐析常数Ks值差别来表达，Ks值越大，盐析效果越好。各种盐类Ks差别可用下列顺序表达：磷酸钾硫酸钠硫酸铵柠檬酸钠硫酸镁。pH值对盐析效果影响 属于两性电解质分子，如蛋白质、酶及氨基酸等，其溶解度与所带电荷关于。当其分子所带正负电荷为零时，分子处在等电状态，此时溶液pH值即为该分子等电点。处在等电点两性分子，溶解度最小；偏离等电点两性分子，溶解度较大。因而在盐析时，普通选取在两性分子等电点处pH值下进行，以获得最佳盐析效果。温度影响 在低离子强度下，蛋白质溶解度随着温度升高而增大；在高离子强度下，则随着温度升高而下降。对于蛋白质来说，盐析对温度规定不是很严格，普通是在常温下进行操作。但是对于酶类，由于其大某些对温度都比较敏感，因而对于酶类盐析时应在较低温度下操作，以最大限度地保持酶活性。2.1.4盐析后脱盐解决惯用脱盐解决有：透析法、电渗析法和葡聚糖凝胶过滤法。这里简朴简介一下透析技术。广义地说，透析也是一种膜分离技术。用于透析膜是一种半透膜，即具备让小分子和水扩散而不断地通过，直到膜内外浓度达到平衡；而大分子则不能透过膜而被截留在膜内侧一种膜。生物细胞膜、羊皮纸、火棉胶、玻璃纸以及赛璐玢等即属于半透膜。用于透析膜，必要具备如下特点：只容许小分子溶质和溶剂通过，大分子不能通过；具备化学惰性，与溶质不起化学作用，在水、盐、稀酸、碱中不溶解；有一定机械强度和良好再生性能。透析办法比较简朴。实验室少量样品可放入做成透析袋内，并留出普通左右体积，然后扎紧袋口，悬挂于盛有纯净溶剂大容器内，即可透析。透析过程中通过搅拌和不断更新新鲜溶剂，可大大提高透析效果。2.1.5硫酸铵饱和度调节办法硫酸铵使用前预解决用普通生化工业制备硫酸铵即可，如果待盐析蛋白质和酶活性中心含巯基，如菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶等属于巯基蛋白酶类制品，则需预解决，去除硫酸铵中重金属离子，以消除其对酶活性影响。办法是将硫酸铵配成浓溶液，然后通入H2S 气体至饱和。放置过夜后用滤纸滤除重金属沉淀物，滤液在瓷蒸发器中浓缩结晶，再在100下干燥即可使用。硫酸铵饱和度调节 当盐析规定饱和度高而又不适当增大溶液体积时，可直接加入硫酸铵固体盐，不同饱和度应加入硫酸铵用量可查阅有关分析手册。当盐析规定饱和度不高，又必要防止局部浓度过高时，普通是采用加入饱和硫酸铵溶液法。盐析时规定饱和度以及所需加入饱和硫酸铵溶液体积计算如下：V=V0(S2-S1)/(1-S2)式中：V-需加入饱和硫酸铵溶液体积；V0-待盐析溶液体积；S1-本来溶液硫酸铵饱和度（第一次盐析时普通为0）；S2-需达到硫酸铵饱和度。25oC时，硫酸铵饱和溶解度是767g/L，定义为100%饱和度2.1.3影响盐析效果因素2.3有机沉淀剂沉淀分离法1、概念：在具有溶质水溶液中加入一定量亲水有机溶剂，减少溶质溶解度，使其沉淀析出。2原理：（1）减少了溶质介电常数，使溶质之间静电引力增长，从而浮现汇集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂水合伙用，减少了自由水浓度，减少了亲水溶质表面水化层厚度，减少了亲水性，导致脱水凝聚。3、惯用有机溶剂沉析剂沉淀金属离子有机沉淀剂：重要涉及生成螯合物有机沉淀剂、生成离子缔合物有机沉淀剂以及生成三元络合物有机沉淀剂。沉淀有机成分有机沉淀剂：可以沉淀水溶液中氨基酸、蛋白质、酶、核酸、多糖、果胶以及其他生化小分子沉淀剂涉及：乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈、异丙醇等，其中最惯用是乙醇和丙酮。V=V0(S2-S1)/(1-S2)式中：V-需加入有机沉淀剂体积；V0-原溶液体积；S1-原溶液中有机沉淀剂浓度；S2-需达到有机沉淀剂浓度。乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒惯用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范畴不广；特点：介电常数小，60%乙醇介电常数是48丙酮介电常数是22容易获取4、有机溶剂沉析特点（1）辨别率高；即一定浓度有机沉淀剂只沉淀分离某一种或某一类溶质组分。（2）溶剂容易分离，并可回收使用；（3）产品干净；沉淀后所得产品不需脱盐，残留沉淀剂通过挥发而易于去除。（4）有机沉淀剂缺陷是容易使蛋白质等某些具备生物活性生物大分子失活；（5）应注旨在低温下操作；（6）成本高5、溶剂选取（1）介电常数要小（2）致变性作用要小（甲醇）（3）毒性要小、挥发性适中（4）水溶性要好6、影响有机溶剂沉淀效果因素（4）2.3.2影响 金属离子助沉析作用：Zn2+、Ca2+当溶液中有某些金属离子存在时，能减少大分子溶质溶解度，同步不影响目的成分生物活性，可使有机溶剂用量减少，这在工业上有实用价值，如Zn2+、Ca2+、在一定pH值条件下能与呈阴离子状态蛋白质形成复合物，这种复合物在水和有机溶剂中溶解度明显减少。盐浓度影响溶液中盐浓度太大或太小，对沉淀均有不良影响。沉淀蛋白质和多糖时，有机溶剂中盐浓度以不超过5%为宜。样品浓度：0.52%稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小浓：节约溶剂用量，共沉作用强，辨别率低溶质相对分子质量与有机溶剂用量影响普通来说，待分离组分相对分子质量越小，有机溶剂用量越多。不同浓度有机溶剂能使溶质中不同组分先后沉淀，因而能起到分步沉淀效果。 温度影响在有机溶剂存在时，蛋白质溶解度随着温度减少而减少。某些具备生物活性生化成分，如蛋白质、酶、核酸等，对温度变化较为敏感。温度升高时，容易发生变性。因而为了尽量地保存制品生物活性，应尽量采用低温操作。低温对于提高沉淀效果也比较有利。总之，低温有助于防止溶质变性；有助于提高收率（溶解度下降）；pH值影响像酶、蛋白质、氨基酸等大多属于两性电解质物质，因而选取其等电点处pH值，可最大限度地进行沉淀。在一定有机溶剂浓度下，变化pH值，就可以进行有选取分段沉淀，用以分离不同组分。搅拌速度：散热（6）离子强度：离子强度低有助于沉析，0.010.05mol/L2.4等电点沉淀分离法2.4.1等电点沉淀分离基本原理等电点沉淀分离法重要是运用两性电解质分子在电中性时溶解度最低，不同两性电解质具备不同等电点而进行分离一种办法。蛋白质是多价两性电解质，普通在偏酸性溶液中带正电，在偏碱性溶液中带负电，在其等电点处静电荷为零，因而容易互相汇集成为较大颗粒而沉淀。蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处在等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜构造被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质汇集体，进而产生沉淀。大豆蛋白“碱提酸沉”法就是运用该原理，其工艺流程为：豆粕原料 一二次碱提粗滤酸沉打浆回调改性喷粉成品 废渣3、特点：由于在等电点附近，溶质依然有一定溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高回收率，因而等电点沉淀法普通与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用操作时注意事项：（1）由于无机离子影响，蛋白质等电点普通会发生“漂移”，阳-高，阴-低（2）溶质稳定性（3）盐析效应九、其他沉淀法（1） 水溶性非离子型聚合物沉淀剂PEG（聚乙二醇）、NPEO（壬苯乙烯化氧）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯惯用此类沉淀剂是PEG，相对分子量普通为6000；（2） 成盐类复合物沉析剂A. 金属复合盐：与生物分子酸性基团作用，Cu2、Ag、Zn2B. 有机酸复合盐：与生物分子碱性基团作用C. 无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐（3） 离子型表面活性剂CTAB（十六烷基三甲基季铵盐溴化物）、十二烷基磺酸钠（SDS）（4） 离子型多聚物沉析剂核酸（多聚阴离子）、鱼精蛋白（多聚阳离子）（5） 氨基酸类沉析剂一类选取性沉淀剂。如组氨酸氯化汞，精氨酸苯甲醛，亮氨酸邻二甲基苯磺酸等（6） 分离核酸用沉析剂酚、氯仿、SDS（7） 分离粘多糖用沉析剂乙醇、CTAB（8）选取性变性沉析法十、本章作业（1）惯用蛋白质沉淀办法有哪些？（2）影响盐析重要因素有哪些？（3）何谓中性盐饱和度？盐析操作中，中性盐用量（40% 硫酸铵饱和度）如何计算？