DNA重组实验中常用的关键技术资料.doc

DNA重组实验中惯用技术
一、质粒DNA提取及鉴定
　　（一）质粒DNA提取及鉴定
　　1．收获细菌
　　（1）将2ml含相应抗生素LB液体培养基加入到通气良好15ml试管中，接入一单菌落，于37℃激烈振荡培养过夜。
　　（2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以1g离心5min，将剩余培养物贮存于4℃。
　　（3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽量干燥。
　　2．碱裂解法小量抽提质粒
　　（1）将细菌沉淀[上述环节（3）所得]重悬于100μl预冷溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0，10mmol/L EDTA）中，激烈振荡。
　　（2）加200μl新配制溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH，1%SDS），缓和振荡，水浴5min。
　　（3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml，冰乙酸11.5ml,水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。
　　（4）4℃以1g离心5min，将上清转移到另一离心管中。
　　（5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，（4）。
　　（6）用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。
　　（7）4℃以1g离心5min。
　　（8）小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁液滴除尽。
　　（9）用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。
　　（10）加50μl1×TE（含20μg/ml无DNA酶胰RNA酶），振荡，贮存于-20℃。
　　（二）质粒DNA大量制备
　　（1）同上1.（1）
　　（2）将1ml含菌液倒入含相应抗生素Lb 100ml中，37℃振荡培养至A590=1.0(5～6h)。
　　（3）加氯霉素（170μg/ml）扩增，37℃温箱中培养过夜。
　　（4）收集菌液于离心管中，冰浴10min。3000rpm,离心10min，去上清。
　　（5）加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。
　　（6）加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀，室温下5min。
　　（7）加溶液Ⅲ7.5ml轻轻混匀，冰浴30min。15000rpm，4℃离心20min。
　　（8）取上清液于高速离心管中，加2倍体积无水乙醇，混匀，入-20℃3～5h。
　　（9）15000rpm 4℃ 离心20min。
　　（10）弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干（10～15min）。
　　（11）用5ml1×TE溶解，加入RNase A 15～20μl，42℃水浴4h于过夜。
　　（12）加入5ml饱和酚，混匀，4000～5000rpm离心5min，取上清液入5ml离心管内。
　　（13）分别加入2.5ml饱和酚，2.5ml氯仿，混匀后同样离心收集上清。
　　（14）加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀，同样离心收集上清。
　　（15）加入1/10体积3mol/l NaAc及2倍体积无水乙醇于-20℃3～5h。
　　（16）10000rpm 4℃离心20min。
　　（17）弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。
　　（18）离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解质粒DNA。
　　（三）质粒DNA鉴定
　　1．酶切反映
　　（1）在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。
　　（2）取反映物点样，观测酶切效果。
　　（3）酶切完全后，70℃5min终结反映。
　　2．琼脂糖电泳
　　（1）配制所需浓度琼脂糖凝胶。
　　（2）在待测DNA样品中加1/5体积溴酚蓝批示剂，混匀后点样。
　　（3）打开电源开关，5V/cm电泳。
　　（4）在UV灯下观测电泳成果。
　　二、DNA重组
　　（一）DNA酶切与连接
　　（1）酶切反映
　　同质粒DNA鉴定，只但是是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增长。
　　（2）加2倍体积预冷无水乙醇和1/10体积3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。
　　（3）15000rpm离心15min，弃上清。
　　（4）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。
　　（5）加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。
　　（6）测定DNA含量。
　　（7）加入线性载体DNA和含量3～4倍于载体待插入DNA片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反映12～16h。
　　（8）连接反映液可置-20℃保存，供转化用。
　　（9）关于待插入DNA片段获得参见附注。
　　（二）大肠杆菌感受态制备及重组DNA转化
　　1．感受态制备
　　（1）接种单菌落于2ml LB培养液中， 37℃过夜。
　　（2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。
　　（3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。
　　（4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。
　　（5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。
　　2．重组DNA转化
　　（1）将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：
转化项目
受体菌
DNA
总体积
DNA对照组
0
10μl
200μl
受体菌对照组
200μl
0
200μl
转化组
190μl
10μl
200μl
　　（2）冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。
　　（3）42℃90s。
　　（4）37℃水浴5min。
　　（5）加入无相应抗生素Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。
　　（6）分别取3组反映物各50μl在含相应抗生素固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。
　　（三）转化子DNA迅速鉴定－迅速细胞破碎法
　　（1）挑取转化平板上单菌接种于含相应抗生素2ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。
　　（2）取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。
　　（3）加入70μl Cracking Gel缓冲液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml，250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g，1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水至200ml]，混匀后，37℃水浴30min以上。
　　（4）15000rpm离心15min。
　　（5）吸取上清点样电泳，观测。
　　（四）转化子DNA酶切鉴定
　　1．转化子DNA迅速少量抽提
　　（1）同本节　二.（三）.1.
　　（2）菌液移至5ml Eppendorf 管中，9000rpm,离心9min，去上清。
　　（3）加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混匀，冰浴10min。
　　（4）15000rpm离心15min。
　　（5）吸取上清，加入异丙醇1ml混匀，置室温15～30min。
　　（6）15000rpm离心15min，弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。
　　（7）离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解DNA。
　　（8）取少量DNA电泳，观测浓度。
　　2．转化子DNA小量酶切鉴定　　同质粒DNA小量酶切鉴定，见本节　一（三）。
　　（五）重组子DNA进一步鉴定
　　可用Southern印迹杂交法或斑点杂交法等进一步鉴定，详见本节　四。
　　[附]电泳洗脱法回收酶切DNA片段
　　（1）用适当酶切割DNA并电泳。
　　（2）于紫外灯下从凝胶上切下所要DNA带，装入含1×TBE缓冲液透析代内，用夹子封好袋口，并检查有无漏孔。
　　（3）将透析袋（纵长）与两极间边线垂直放于电泳槽内电泳，4～5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。
　　（4）取出透析袋，挤出凝胶块，吸出袋内液体放入1.5ml离心管内，10000rpm离心5min。
　　（5）吸出上清放入离心管内，加入等体积饱和酚和等体积氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，吸出上清放入新离心管内。
　　（6）加入1/10体积3mol/L AaAc,2倍体积预冷无水乙醇，于-20℃放置4～5h。
　　（7）于4℃，10000rpm离心15min，弃上清。
　　（8）用75%酒精洗涤2次，每次均于4℃，10000rpm离心5min，弃上清。
　　（9）真空抽干，并用适量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。
　　三、地高辛配基随机标记DNA探针法
　　（一）概述
　　基因诊断是以核酸分子杂交技术为基本，在核酸水平检测人类遗传性疾病基因缺陷和某些传染病病原体办法。其基本过程是：制备DNA探针，标记探针，检测样本。开展这项工作核心是要得到高敏捷度、高特异性探针。以往人们是用放射性同位素来标记探针DNA。近年来，非同位素标记办法发展不久，已有取代同位素标记法趋势。地高辛配基随机标记DNA探针法，是较为成功一种非同位素标记办法。其原理是：用化学办法把类固醇类半抗原地高辛分子连接在dUTP上（Dig-dUTP）。用随机引物及DNA多聚酶，以探针DNA为模板，合成互补DNA，化学修饰过dUTP同步掺入到标记DNA探针中。杂交后用碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗与标记探针DNA中Dig-dUTP结合，加入显色底物，在碱性磷酸酶作用下，转变成深棕色或蓝色化合物。
　　1．标记　本试剂盒采用随机引物标记办法，可标记少至10ng，多至3μgDNA。能在新合成DNA链每20～25个核苷酸，掺入一种Dig-dUTP，反映时间约为1h。
　　2．杂交　按原则杂交办法进行。可以采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。用过杂交液可冻存于-20℃，重复使用。
　　3．免疫学检测　封阻后，检测反映第一步，抗体结合物与标记DNA结合，浮现杂交半抗原-标记DNA，显色反映起始是在碱性pH条件下加入无色显色剂X-磷酸盐和NBT，在几分钟内便开始浮现蓝色，显色反映过程持续3d。典型例子是在24h后终结显色反映。用二甲基甲酰胺洗掉尼龙膜上颜色后，尼龙膜可重新用于杂交。
　　4．应用　地高辛配基标记DNA探针及检测试剂盒，能检测0.1pg同源DNA，能检测1μg哺乳动物DAN中单拷贝基因，与放射性标记系统比较，此试剂盒能迅速得到实验成果（从DNA标记和杂交至见到检测成果24h内能完毕），并且消除了放射性不安全问题。这试剂敏捷度与特异性使它合用于所有杂交技术（涉及DNA-印迹转移，菌落杂交，噬菌斑杂交及原位杂交）以代替同位素标记和放射自显影术。
　　（二）试剂盒成分
　　1．无标记对照DNA1　此管内有20μl pBR328 DNA100μg/ml,pBR328分别用BamHⅠ,BglⅠt HinfⅠ消化，它们混合比例为2：3：3，共有16个Pbr328片段，这些片段大小分别为：4907，2176，1766，1230，1033，653，517，453，298，234，234，220和154×2bp。
　　2．无标记对照DNA2　此管内有20μl pBR328 DNA200μg/ml，已用EcoRⅠ线性化。
　　3．DNA稀释缓冲液　有两管，每管1ml[成分为：Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(1mmol/L),pH8.0(20℃)]内含鲑鱼精DNA（50μg/ml）。
　　4．标记对照DNA　此管内有50μl线性化pBR328DNA，按标记办法已标记有地高辛配基dUTP,含20μg模板DNA，每毫升含5μg合成标记DNA。
　　5．六聚核苷酸混合物
　　6．标记用混合底物　此管内有50μl 10倍浓度dNTP标记用混合底物，含dATP（1mmol/L）dCTP(1mmol/L),dGTP(1mmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20℃)。
　　7．DNA聚合酶Ⅰ大片段（标记级）　此管内有25μl DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow），2U/μl。
　　8．（Dig）AP结合物　此管内有200μl多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，结合有碱性磷酸酶750U/ml。
　　9．NBT　有两管，每管1.25ml，是溶于70%（V/V）二甲基甲酰胺硝基蓝四唑盐溶液（75mg/ml）。
　　10．X-磷酸盐　有两管，每管0.9ml，是溶于二甲基甲酰胺5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐甲苯胺溶液（50mg/ml）。
　　11．封阻试剂　有两瓶，每瓶有50g粉剂。
　　（三）需配制溶液
　　EDTA（0.2mol/L）,pH8.0 (20℃);LiCl(4mol/L);70%(V/V)乙醇；Tris-HCl(10mmol/L);ED－TA(1mmol/L),pH8.0(20℃);10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸钠盐；10%（V/V）SDS；20×SSC：3mol/l NaCl;0.3mol/L柠檬酸三钠；pH7.0 Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L);pH7.5Tris –HCl(100mmol/L);NaCl(100mmol/L);MgCl2(50mmol/L)pH9.5(20℃)。
　　（四）操作办法
　　1．标记DNA探针　每次原则反映可标记10ng至3μg线性DNA，也可标记更大量DNA，但所有成分和体积要相应增长。
　　（1）DNA探针热变性，煮沸10min，迅速冷却于冰/乙醇中5min以上，待用。
　　（2）取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上，加下列及试剂：
　　新鲜变性DNA 　　　　　　　　　　1-3μg
　　六聚核苷酸混合物 　　　　　　　　2μl（管5）
　　dNTP标记用混合底物 　　　　　　　2μl（管6）
　　加无菌重蒸水至　　　　　　　　　 19μl
　　DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）　　　1μl（管7）
　　（3）在37℃保温至少60min，可到20h。
　　（4）煮沸5min，终结反映。
　　（5）15000rpm离心30s，置于冰上待用。
　　2．预杂交　按100cm2膜用20～40ml预杂交溶液，预杂交时使溶液处在流动状态。
　　预杂交液构成：5×SSC
　　0.5%（W/V）封阻试剂（管11）
　　0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠
　　0.02%（W/V）SDS
　　膜放入塑料袋，灌入预杂交液，排除气体后密封，在65℃预杂交过夜。
　　3．杂交　按100cm2膜用2.5ml杂交液，杂交时偶尔摇动杂交袋，使里面溶液重新分派。
　　杂交液构成： 50%甲酰胺（V/V）
　　5%（W/V）封阻试剂
　　5×SSC
　　0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠
　　0．02%(W/V)SDS
　　新变性标记DNA（150ng/ml）
　　杂交液取代预杂交液，替代间膜不能干，成功地替代应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42℃杂交过夜（16～20h）。
　　4．洗膜　　按100cm2膜用250ml洗膜液计算。
　　（1）在室温下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。
　　（2）在65℃条件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。
　　（3）在室温下用2×SSC溶液漂洗1次。
　　5．免疫测定
　　（1）配制溶液
　　缓冲液1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃）
　　缓冲液2：0.5%(W/V)封阻试剂(管11),配制于缓冲液1中(封阻试剂不会迅速溶解,因而应预早1h前配制此溶液,将试剂溶于50～70℃,此溶液保持混浊)。
　　缓冲液3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。
　　缓冲液4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)
　　显色溶液：新鲜配制，在10ml缓冲液3中，加45μlNBT溶液（管9）和35μlX-磷酸盐缓冲液（管10）。
　　2． 显色过程
　　A．膜在缓冲液1中短暂洗涤（1min）。
　　B．在100ml缓冲2中保温30min。
　　C．再用缓冲液1短暂洗涤。
　　D.用缓冲液1稀释抗体结合物(管8)至150U/L(1:5000);稀释后抗体结合物在4℃只能稳定12h。
　　E.膜在20ml稀释抗体结合物溶液中保温30min。
　　F.用100ml缓冲液1洗膜,以除去未结合抗体结合物,15min,2次。
　　G.膜在缓冲液3中平衡2min。
　　H.在黑暗条件下,膜与10ml显色溶液放入塑料袋内密封或放入适当盒子内,几分钟内开始浮现颜色,普通显色反映在1天后所有完毕。当颜色显影时，不可振荡或搅拌。
　　I．当规定点或带已被检测时，可用50ml缓冲液4洗膜5min终结反映。
　　J．摄相。
　　阐明：上述各反映均在室温下进行，除了显色反映外，均需振荡或搅拌。
　　（五）排除实验中问题办法
　　1．DNA不能有效地被标记时考虑
　　（1）用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新纯化DNA。
　　（2）标记反映保温时间延长（增至20h）。
　　（3）DNA变性或许不完全，这时对大片段DNA特别重要。
　　2．不能达到预期敏捷度时考虑
　　（1）DNA标记率。
　　（2）增长标记DNA浓度或增长杂交时间。
　　（3）显色反映时间可延长至3d。
　　3．若显色时背景过深，可采用
　　（1）在杂交溶液中减少标记DNA量。
　　（2）增长杂交溶液体积，使膜随意漂浮在溶液中。
　　（3）某些类型尼龙膜也许产生深色背景，因而可采用其他类型尼龙膜或改用硝酸纤维素膜。
　　（4）在杂交和检测过程中增长封阻试剂浓度。
　　四、核酸分子杂交
　　核酸分子固相杂交是将待测核酸样品结合在某种固相支持物上，然后与溶液中标记探针进行杂交。当前使用最多固相支持物是硝酸纤维膜。这里重点简介直接点样技术，转移技术及其他惯用杂交技术。
　　（一）斑点杂交直接点样法
　　斑点杂交或叫打点杂交（dot-blot hybridization），其重要特点是事先不用限制内切酶消化或用凝胶电泳分离核酸样品，操作简便，敏捷度高。一种点样品只含0.25～1pgDNA也能检测到。但不懂得杂交片段大小（碱基对数）。
　　1．DNA打点法（DNa Dot Blot）
　　（1）膜解决：戴上干净手套，取出硝酸纤维膜，按需要剪成一定大小，量好各样点间距离，用软铅笔标记。
　　（2）DNA变性：将DNA溶液于1×TE（pH8.0）缓冲液中或蒸馏水中，取一定量DNA样品加于小塑料管中，在100℃沸水中煮10min，迅速入冰水中。
　　（3）点样：用塑料或硅化玻璃或微量加样器取1～5μl变性DNA，将滴管放在硝酸纤维膜上，使DNA慢慢吸在滤膜上，点样完后凉干。
　　（4）固定：将凉干滤膜夹在滤纸中，于80℃干烤2～3h，然后进行杂交。
　　2．RNA打点法（RNa Dot Blot）
　　（1）膜解决：同DNA打点法。
　　（2）RNA变性：将提取RNA与50μl 20×SSC/甲醛（30μl 20×SSC加20μl甲醛）混合，65℃水浴15min。
　　（3）点样：同DNA打点法。
　　（4）固定：同DNA打点法。
　　（二）DNA吸印转移法（Southern Blot）
　　DNA通过限制性内切酶消化和凝胶电泳后，放入碱性溶液中使其变性，将变性后单链DNA从凝胶中按本来位置和顺序用滤纸吸印转移到硝酸纤维膜上，然后再与标记探针杂交。此办法比较精确地保持了特异DNA序列在电泳图谱中位置，并且能测定分子量。
　　试剂：变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl
　　中和液：1mol/l Tris-HCl，1.5mol/L NaCl pH8.0
　　20×SSC:0.3mol/L柠檬酸钠，3mol/l NaCl
　　1．电泳　取DNA约5μg加限制性内切酶进行酶切，电泳鉴定酶切完全后，取酶消化后DNA点样于0.8%～1.2%凝胶上，以0.8～1V/cm电压电泳过夜，在溴酚蓝离凝胶前缘0.5cm处停止电泳。将电泳后凝胶翻转，紫外灯照射10～20min后拍照。
　　2．变性与中和　将电泳后凝胶放入变性液中25℃振荡60min。蒸馏水洗胶1min，将凝胶放入中和液中25℃振荡60min。
　　3．转移　取托盘一只，放入10×SSC溶液约500～1000ml，托盘上搭一块比凝胶稍宽长方形玻璃，取一长方形Wateman paper（滤纸）搭在桥上，两边浸入10×SSC溶液中，仔细去掉玻璃与滤纸之间气泡（用玻棒在滤纸上滚动）。将凝胶放在滤纸上，去掉凝胶与滤纸之间气泡。将硝酸纤维膜放入2×SSC溶液中浸湿后放在凝胶上（如NC膜浸湿不均匀，则考虑更换NC膜，操作时手切勿触及NC膜），去掉凝胶与NC膜之间气泡。将一张滤纸（长和宽均比NC膜小1mm）放在NC膜上，仔细去掉气泡。将吸水纸切成与滤纸大小，重叠放在滤纸上，再压一重物约500～1000g。转膜24h，中间更换吸水纸。

图23-7　Southern转膜示意图
　　4．固定　　用2×SSC溶液洗膜5min去掉残存凝胶，让膜自然凉干。将凝胶放入EB液中30min，取出在UV灯下观测与否有DNA残存。80℃烤膜2h，然后将膜封入塑料袋进行杂交。
　　（三）RNA吸印转移法（Northern blot）
　　在RNA凝胶电泳之前，先用乙二醛等变性剂解决RNA，再在适当条件下电泳使充分变性RNA直接吸印到硝酸纤维膜上。固定后除去变性剂，然后进行杂交。
　　试剂：
　　乙二醛：4mol/L（约为30%），通过阴阳离子互换树脂纯化，使pH为5.5～6.0
　　磷酸缓冲液：80mmol/L pH6.5～7.0
　　磷酸缓冲液：10mmol/L pH6.5～7.0
　　Tris-HCl:20mmol/L pH7.8
　　二甲基亚砜：分析纯
　　20×SSC：0.3mol/L柠檬酸钠，3mol/l NaCl
　　1.RNA变性　吸取1μl 80mmol/L磷酸缓冲液，1μl RNA样品（最多100μg），2μl，4mol/l 乙二醇，4μl二甲基亚砜。混匀后，50℃水浴1h，然后放入冰中。
　　2．电泳　变性结束后，加入具有50%甘油10mmol/L磷酸缓冲液2μl和少量溴酚蓝，混匀后点样于1.0%凝胶上，以4～5V/cm电压电泳。凝胶电泳液为10mmol/L磷酸缓冲液，pH6.5～7.0。
　　3．转移　变性解决后RNA可以转移并结合到硝酸纤维膜上，转移过程和转移变性与DNA相似。
　　4．固定　用20×SSC转移RNA。膜夹在两层干净滤纸中凉干后，80℃烤膜2h
　　5．乙二醛附加物消除　RNA膜固定后，放入20mmol/l Tris-HCl中，100℃解决5～10min，去除乙二醛，然后进行杂交。
　　（四）硝酸纤维膜固相杂交
　　核酸样品通过直接点样或转移到硝酸纤维膜上，固定后，可以进行杂交反映。在杂交溶液中，硝酸纤维膜上变性核酸样品和变性后探针在一定条件下形成双链杂交核酸分子。然后进行酶标显色。
　　试剂及操作办法见本节　三。
　　五、真核细胞基因组DNA制备
　　从不同组织细胞或血细胞中提取DNA是进行基因诊断先决条件。制备DNA原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净，又要保持DNA分子完整。蛋白酶K应用使这两个原则得到了保证。在提取DNA反映体系中，SDS是离子型表面活性剂，重要作用是：（1）溶解膜蛋白而不破坏细胞膜；（2）解聚细胞中核蛋白；（3）与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来。蛋白酶K可将蛋白降解成小多肽和氨基酸，使DNA分子尽量完整地分离出来。详细办法如下：
　　（一）白细胞DNA制备
　　（1）采集外周静脉血10ml，加1.7ml ACD（柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm2灭菌30min）抗凝。
　　（2）将血液放入已灭菌50ml塑料离心管内，加30mlSTMT[0.32mol/L蔗糖、10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)、5mmol/L MgCl2、1%Triton –X 100]，轻轻上下振荡至透明，红细胞完全溶解。
　　（3）冰浴10min，离心，3000rpm，10min。弃上清，STMT重复解决1～3次。
　　（4）弃上清，白色沉淀物加10ml STE[0.1mol/L NaCl、10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)]，先少量，充分混匀，然后加10mg/ml蛋白酶K100μl，20%SDS30μl，摇匀，置37℃水浴15～20h。
　　（5）用等体积饱和酚抽提，3000rpm离心5min。
　　（6）用大口钝缘吸管小心吸取上层水相，加饱和酚和氯仿-异戊醇（24：1）抽提，3000rpm离心5min 。
　　（7）小心吸取上层水相，用等体积氯仿-异戊醇（24：1），抽提，3000rpm离心5min。
　　（8）小心吸取上层水相，加入1/10体积3mol/l NaAc,2.5体积预冷无水乙醇混匀，-20℃过夜。
　　（9）将白色絮状沉淀物用玻璃棒挑出，放入Eppendorf管内，加1ml 75%乙醇4℃静置1h，离心，10000rpm 10min。
　　（10）弃上清，用蜡膜将管口封好，针刺数个小孔，真空抽提（10～15min）。
　　（11）加200μl 1×TE溶解，置4℃保存。
　　（12）对所提DNA用紫外分光光度计进行定量和纯度检测。
　　（13）取2～4μl DNA样品，经琼脂糖凝胶（Agarose）电泳，检查所提DNA质量及降解状况。
　　（二）组织DNA制备
　　（1）将200mg组织在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎，加4ml 1×RSB缓冲液（10mmol/L Tris，pH7.4;10mmol/l NaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4）放入10ml带盖塑料管中。
　　（2）加SDS至浓度为1%（可加0.4ml10%SDS），混匀。由于DNA从核中释放出来，样品变得粘稠。
　　（3）加10mg/ml蛋白酶k 44μl，终浓度为100μl/ml，37℃保温1～3d，直到组织完全解体。中间可振动样品管几次。加0.4ml 5mol/L NaCl。
　　（4）用等体积饱和酚、1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿-异戊醇及等体积氯仿-异戊醇（24：1）各抽提一次，3000rpm离心5min，用大口钝缘吸管小心吸取上层水相。
　　（5）加2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA。用一玻璃棒收集白色纤维丝状大片段DNA，并移入一新管，吸干DNA中无水乙醇。
　　（6）DNA溶于4ml 0.1×SSC中，4℃过夜可作进一步纯化。
　　（7）加20μl RNase A(10mg/ml),37 ℃保温5h。加0.4ml 5mol/L NaCl。
　　（8）同上法用饱和酚、氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀离心，弃上清。
　　（9）75%乙醇洗涤2次，离心，弃上清，真空抽干。适量1×TE溶解，保存在4℃。
　　六、转移基因
　　最惯用将克隆重组DNA片段导入哺乳动物细胞办法是用磷酸钙介导转染。转染DNA也许是通过吞饮作用进入细胞质，然后进行细胞核。
　　（1）配制下列溶液
　　①2×HEPES-缓冲盐溶液（HBS）
　　②2mol/L CaCl2
　　③0.1×TE(pH8.0)用0.22μm滤器过滤除菌，分装贮存于4℃。
　　④DNA：将DNA（约20μg/106细胞）溶于0.1×TE（pH8.0），使用浓度为40μg/ml。为使转化效率达到最高，质粒DNA应用CsCl-溴化乙锭密度梯度平衡离心法纯化。如果所用DNA量较少，应加入载体DNA将DNA浓度调至40μg/ml。实验室制备真核载体DNA转染效率普通要比商品化牛胸腺DNA、鲑鱼精DNA高。载体DNA用前应通过乙醇沉淀或氯仿抽提进行灭菌。
　　（2）转染前24h用胰蛋白酶进行消化以获得对数生长期细胞，以1～2×105细胞/cm2密度重新种入60mm组织培养皿中。在37℃、5%～7%CO2及一定湿度培养箱中培养20～24h。
　　（3）每转染一种60mm培养皿中单层细胞，须依如下办法制备磷酸钙-DNA共沉淀物：取环节一所制备DNA[40μg/ml，溶于0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用灭菌5ml塑料管中，缓慢加入31μl 2mol/l 氯化钙（温和混合30s左右）。于室温育20～30min，其间将形成细小沉淀。温育结束时，用吸管将混合液吹打一次，使沉淀物悬浮。
　　普通采用另一方案是将氯化钙和DNA稀释混合液加入2×HBS溶液中，逐滴加入并小心混合250μl按环节一制备并溶于氯化钙（250mmol/L）DNA。按照前述办法温育之。
　　如果需要转染更为大量细胞，上述两种反映混合液体积均可翻一番或翻两番。如果体积翻两番，则须使用更大塑料管，普通在25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿上，可将0.5ml磷酸钙-DNA共沉淀物加入5ml培养液中，而在90mm细胞培养皿上，普通将1ml沉淀物加入10ml培养液中。
　　已经刊登方案中，混合各组分方式与速率大不相似。其中有某些以为除了温和振摇之外，其他办法均无济于事，并建议用电动移液装置吹出空气来混合溶液。其他某些方案则规劝在加入DNA溶液时持续而缓慢地混匀，然后再温和振荡。其目是为了避免急速形成粗沉淀物，以致减少转化效率。事实上，除了混合速度之外，尚有其他若干因素涉及DNA浓度和大小（让高分子量DNA从细针头中通过，可将之剪切变小）、缓冲液精准pH（有些工作者配制了几批pH范畴从6.95至7.1不等HBS缓冲液，逐批实验沉淀物质量及转染效率）。如果必要使转染效率达到最高，就要花时间针对特定系统优化上述几种因素。一旦得到一批灵验试剂，只需依照前面办法进行配制和贮存，即可在长期内获得可重复成果。
　　（4）将磷酸钙-DNA悬液转移至细胞单层上培养液中[在60mm培养皿中，可将0.5ml悬液加入5ml培养液中]，轻轻左右晃动一下培养皿使培养液得以混合，此时可见培养液成黄橙色浑浊状。另一办法是吸出培养液，直接把沉淀物加到细胞上，将细胞置于室温温育15min，然后再将培养液加回到培养皿中，此时细胞上有许多细小颗粒。采用以上两种办法，都要在37℃、5%～7%CO2及一定湿度培养箱中将转染细胞培养长达24h[时间长短取决于后续解决环节不同，见环节（5）]。
　　（5）然后，转染细胞可依如下任一种办法解决：
　　①如果不进行其他解决（如用氯喹、甘油或丁酸钠等试剂解决，见后），可在细胞培养16～24h后，吸出培养液和沉淀物，用PBS将单层细胞再洗一次。然后按下述③d操作。
　　②在许多状况下，同步用氯喹解决细胞，可提高DNA摄入率。氯喹也许是通过抑制溶酶体水解酶类对DNA降解而起作用。氯喹浓度及其解决时间不能超越细胞对其毒性作用耐受能力。因而必要通过预实验来决定适于所用特定型别细胞最佳氯喹浓度。但对于大某些型别细胞，用终浓度为100μmol/L氯喹解决3～5h，都可获得良好效果。可在磷酸钙-DNA共沉淀物加入细胞之前或之后（见环节（4）简介其他办法），直接将氯喹二磷酸贮存液（过滤除菌并贮于-20℃用金属泊密封管中，100mmol/L）稀释（1：100）于培养液中。在氯喹解决过程中，细胞呈现泡状是正常。经用DNA和氯喹解决3～5h后，弃去培养液和沉淀，用PBS洗，然后按下述d操作。
　　③用甘油短暂解决细胞，同样可提高转化效率或导入DNA瞬时表达水平。这一环节可以在氯喹解决之后进行。由于不同细胞对甘油毒性作用敏感性相差悬殊，因而每种型别细胞都必要通过预实验决定最佳解决时间（从30s至3min）。耐受甘油细胞可以暴露于含磷酸钙-DNA共沉淀物（含或不含氯喹）生长液3～5h后进行休克。
　　a. 吸出生长液，用PBS将单层细胞洗1次；
　　b.在单层细胞中加入1.5ml溶于1×HBS15%甘油，在37℃培养0.5～3min；
　　c.吸出甘油，用PBS将单层细胞洗1次；
　　d.加入5ml预加温完全生长液，放入培养箱中继续培养24～60h后，检测DNA瞬时表达或将细胞重新种入恰当选取性培养基中，分离稳定转化体。
　　④业以表白，丁酸钠也可以在猴源和人源细胞中增强带SV40初期启动子/增强子重组质粒表达。可直接在生长液中加入关于试剂，也可以使通过甘油休克细胞接受丁酸钠解决。须视细胞型别不同，采用不同浓度丁酸钠（500mmol/L贮存液，在化学通风橱中用NaOH中和丁酸制备而成），例如：
CV-1　　　　10mmol/L
NIH-3T3　　 7mmol/L
HelaS3　　　5mmol/L
CHO 　　　　2mmol/L
　　不加完全生长液，然后重复环节d。
　　（6）转移基因表达和细胞集落形成
　　①瞬时表达：在转染后48～60h收获细胞，进行RNA或DNA杂交分析。新合成蛋白质可以用放射免疫测定Western印迹，体内代谢标记－免疫沉淀或者细胞提取液中酶活性测定等办法来进行分析，如果测定中有重复品或者转染细胞要通过各种不同条件或在一段时间历程以内取不同步间进行解决，就要避免皿与培养皿之间转染效率偏差。在这些状况下，最佳转染大片单层细胞（90mm培养皿），培养24h后用胰蛋白酶进行消化，再分接到若干较小培养皿上。
　　②稳定转化：在非选取性培养基中培养18～24h，使所转移基因得到表达之后，用胰蛋白酶消化细胞，种入恰当选取性培养基中。这种培养基在2～3周内每2～4d须更换1次，以便除去死细胞残骸并使抗性细胞集落得以生长。
　　可以克隆单个细胞集落，增殖后进行测定。可以用冰预冷甲醇将仍保存在培养皿内细胞固定15min，再于室温用10%Giemsa染色15min，最后用自来水冲洗，这样即可得到细胞集落数永久记录。Giemsa染液可用PBS或水现用现配，并用Whatman 1号滤纸过滤。
　　重新接种细胞以便获得分隔良好细胞集落所规定稀释倍数，重要由稳定转化效率来决定。这一效率可以相差若干个数量级，它起决于：a.受体细胞型别（虽然同一细胞系，克隆不同或传代数不同，也体现出明显差别）；b.导入基因特性及其转录调控信号强弱；c.转染中所用供体DNA量