葛根提取物的关键技术要求.doc

葛根提取物技术规定

本技术规定编写格式是按GB/T 1.1-《原则化工作导则》关于规定编辑。
本技术规定检查办法引用了《中华人民共和国药典》一部；GB/T 5009.11；GB 5009.12；GB/T 5009.13；GB/T 5009.15；GB/T 5009.17；GB/T 5009.19等国标，以保证检查数据精确性。
本技术规定附录A、附录B均为规范性附录。
1 范畴
本技术规定合用于以豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 干燥根（习称野葛）为原料经加工制成提取物。
2 规范性引用文献
本技术规定中引用文献对于本技术规定应用是必不可少。凡是注日期引用文献，仅所注日期版本合用于本技术规定。凡是不注日期引用文献，其最新版本（涉及所有修改单）合用于本技术规定。
GB/T 5009.11 食品中总砷及无机砷测定
GB 5009.12 食品中铅测定
GB/T 5009.13 食品中铜测定
GB/T 5009.15 食品中镉测定
GB/T 5009.17 食品中总汞及有机汞测定
GB/T 5009.19 食品中有机氯农药多组分残留量测定
GB 4789.2 食品卫生微生物学检查 菌落总数测定
GB 4789.3 食品卫生微生物学检查 大肠菌群测定
GB 4789.4 食品卫生徽生物学检查 沙门氏菌检查
GB 4789.5 食品卫生微生物学检查 志贺氏菌检查
GB 4789.10 食品卫生微生物学检查 金黄色葡萄球菌检查
GB 4789.11 食品卫生微生物学检查 溶血性链球菌检查
GB 4789.15 食品卫生微生物学检查 霉菌和酵母菌计数
《中华人民共和国药典》一部

3 技术规定
3.1 制法 取葛根，粉碎成粗粉，加30%乙醇加热回流提取两次，每次2小时，第一次加10倍量，第二次加8倍量，滤过，合并滤液，滤液于60℃减压浓缩至相对密度为1.10～1.20（室温）清膏，放冷，加乙醇使含醇量为70%，静置12小时，取上清液，减压回收乙醇，并浓缩至稠膏，干燥，即得。
3.2 感官规定：应符合表 1 规定。
表1 感官规定
项 目
要 求
色泽
淡黄色至棕黄色、色泽均匀。
滋味及气味
具备本品应有气味、味微甜。
性状
干燥均匀粉末。
杂质
无肉眼可见杂质。

3.3 功能成分：应符合表2规定。
表2 功能成分
项目

指标
葛根素（C21H20O9）(以干燥品计)/( mg/g)
≥
100.0
其他异黄酮总量（大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素）(以干燥品计)/( mg/g)
≥
25.0
葛根素与其他异黄酮总量（大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素）比值
≤
8.0

3.4 理化指标：应符合表3规定。
表3 理化指标
项目

指标
薄层鉴别

应符合规定
水分/%
≤
5.0
炽灼残渣/%
≤
5.0
铅（以Pb计）/( mg/kg)
≤
2.0
镉（以Cd计）/( mg/kg)
≤
0.3
砷（以As计）/( mg/kg)
≤
2.0
汞（以Hg计）/( mg/kg)
≤
0.2
铜（以Cu计）/( mg/kg)
≤
20
六六六/( mg/kg)
≤
0.02
滴滴涕/( mg/kg)
≤
0.02
特性图谱

应符合规定

3.5 微生物指标：应符合表4规定。
表4 微生物指标
项目

指标
菌落总数/（cfu/g）
≤
1000
大肠菌群/（MPN/100g）
≤
40
霉菌/（cfu/g）
≤
25
酵母菌/（cfu/g）
≤
25
沙门氏菌
≤
不得检出
志贺氏菌
≤
不得检出
金黄色葡萄球菌
≤
不得检出
溶血性链球菌
≤
不得检出

4 检查办法
4.1 感观检查 取适量试样，置于白瓷板上，在自然光下，用肉眼观测其色泽、性状、杂质，闻其气味，用温开水漱口，品尝其滋味。
4.2 功能成分检查
按规范性附录A规定办法测定。
4.3 理化检查
4.3.1 薄层鉴别 取本品0.1g，加甲醇10ml，超声解决20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取葛根对照药材0.8g，加甲醇10ml，放置2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为对照药材溶液。再取葛根素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中华人民共和国药典一部附录Ⅵ B）实验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇-水（7：2.5：0.25）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和葛根素对照品色谱相应位置上，显相似颜色荧光条斑。
4.3.2 水分：按《中华人民共和国药典》一部附录Ⅸ H（第一法）测定，不得过5.0%。
4.3.3 炽灼残渣：按《中华人民共和国药典》一部附录Ⅸ J测定，不得过5.0%。
4.3.4 铅：按GB 5009.12《食品中铅测定》规定办法测定。
4.3.5 镉：按GB/T 5009.15《食品中镉测定》规定办法测定。
4.3.6 砷：按GB/T 5009.11《食品中总砷及无机砷测定》规定办法测定。
4.3.7 汞：按GB/T 5009.17《食品中总汞及有机汞测定》规定办法测定。
4.3.8 铜：按GB/T 5009.13《食品中铜测定》规定办法测定。
4.3.9 六六六及滴滴涕：按GB/T 5009.19《食品中有机氯农药多组分残留量测定》规定办法测定。
4.3.10 特性图谱
按规范性附录B规定办法测定。
4.4 微生物检查
4.4.1 菌落总数：按GB 4789.2 《食品卫生微生物学检查 菌落总数测定》规定办法测定。
4.4.2 大肠菌群：按GB 4789.3 《食品卫生微生物学检查 大肠菌群测定》规定办法测定。
4.4.3 霉菌和酵母菌：按GB 4789.15 《食品卫生微生物学检查 霉菌和酵母菌计数》规定办法测定。
4.4.4 沙门氏菌：按GB 4789.4 《食品卫生徽生物学检查 沙门氏菌检查》规定办法测定。
4.4.5 志贺氏菌：按GB 4789.5 《食品卫生微生物学检查 志贺氏菌检查》规定办法测定。
4.4.6 金黄色葡萄球菌：按GB 4789.10 《食品卫生微生物学检查 金黄色葡萄球菌检查》规定办法测定。
4.4.7 溶血性链球菌：按GB 4789.11 《食品卫生微生物学检查 溶血性链球菌检查》规定办法测定。
5 贮藏
密封，置凉暗干燥处。

附 录 A
(规范性附录)
功能成分检查

葛根素、其他异黄酮总量（大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素）、葛根素与其他异黄酮总量（大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素）比值测定
A.1 原理
用60%乙醇作为溶剂，超声提取试样中葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素，经高效液相色谱柱（C18）分离，紫外检测器（UV）检测，依照色谱峰保存时间定性，峰面积外标法定量，测定试样中葛根素、其他异黄酮（大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素）含量，并计算葛根素与其他异黄酮总量（大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素）比值。
A.2 试剂
A.2.1 水：纯化水。
A.2.2 甲醇、色谱纯。
A.2.3 乙腈：色谱纯。
A.2.4 乙酸铵：分析纯。
A.2.5 冰乙酸：分析纯。
A.2.6 乙醇：分析纯。
A.2.7 0.02mol/L乙酸铵（pH 4.6）：称取乙酸铵1.54g，加水约900ml，搅拌使溶解，用冰醋酸调节pH值至4.6，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。
A.2.8 葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素对照品：由中华人民共和国药物生物制品检定所提供。
A.3 仪器
高效液相色谱仪，带紫外检测器。
超声波清洗器。
A.4 分析环节
A.4.1 色谱条件与系统合用性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（AichromBond-AQ C18 4.6×250mm 5μ，或相称者）；以乙腈为流动相A，以0.02mol/L乙酸铵溶液（用冰乙酸调pH值至4.6）为流动相B，按下表中规定进行梯度洗脱；流速为1.0 ml/min；检测波长为260nm。理论板数按葛根素峰计算应不低于5000。
时间（min）
A（%）
B（%）
0.0～9.0
9.0～10.0
10.0～12.0
12.0～18.0
18.0～18.5
18.5～26.0
20～30
30
30～48
48
48～20
20
80～70
70
70～52
52
52～80
80

A.4.2 色谱图

A.4.3 溶液制备
A.4.3.1 对照品混合溶液制备 取葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1ml中含葛根素1mg、大豆苷0.2mg、染料木苷0.1mg、大豆素0.1mg和染料木素0.1mg混合溶液，摇匀，即得对照品混合溶液。
A.4.3.2 供试品溶液制备 取本品约50mg，精密称定，置25ml量瓶中，加60%乙醇适量，超声解决30分钟，放冷至室温，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
A.4.4 原则曲线制备 分别精密量取对照品混合溶液0.05、0.1、0.5、2.0、5.0ml,置10ml量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，得对照品系列溶液。分别精密吸取对照品系列溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度（μg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制原则曲线。
A.4.5 精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按原则曲线法以峰面积计算，即得。

A.4.6 计算
C×25
X=
W×（1-M）
式中：
X－试样中单一成分含量，mg/g；
C－从原则曲线上求得供试品溶液中相应成分浓度，μg/ml；
W－取样量，mg；
M－水分，%。
计算成果保存至小数点后一位。
A.4.7 容许差
同同样品两次测定，相对平均偏差不得超过5.0%。
附 录 B
(规范性附录)
特性图谱

B.1 原理
用60%乙醇作为溶剂，超声提取试样中特性成分，经高效液相色谱柱（C18）分离，紫外检测器（UV）检测，依照参照物色谱峰保存时间，计算各特性峰相对保存时间。
B.2 试剂
B.2.1 水：纯化水。
B.2.2 甲醇、色谱纯。
B.2.3 乙腈：色谱纯。
B.2.4 乙酸铵：分析纯。
B.2.5 冰乙酸：分析纯。
B.2.6 乙醇：分析纯。
B.2.7 0.02mol/L乙酸铵（pH 4.6）：称取乙酸铵1.54g，加水约900ml，搅拌使溶解，用冰醋酸调节pH值至4.6，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。
B.2.8 葛根素由中华人民共和国药物生物制品检定所提供。
B.3 仪器
高效液相色谱仪，带紫外检测器。
超声波清洗器
B.4 分析环节
B.4.1 色谱条件与系统合用性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（AichromBond-AQ C18 4.6×250mm 5μ，或相称者）；以乙腈为流动相A，以0.02mol/L乙酸铵溶液（用冰乙酸调pH值至4.6）为流动相B，按下表中规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为260nm。理论板数按葛根素峰计算应不低于5000。

时间（min）
A（%）
B（%）
0.0～9.0
9.0～10.0
10.0～12.0
12.0～18.0
18.0～18.5
18.5～26.0
20～30
30
30～48
48
48～20
20
80～70
70
70～52
52
52～80
80

B.4.2 溶液制备
参照物溶液制备 取葛根素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含葛根素1mg溶液，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液制备 取本品50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加60%乙醇适量，超声解决30分钟，放冷至室温，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
B.4.3 测定法 分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
B.4.4 成果判断：供试品特性图谱中应有5个特性峰，与参照物峰相应峰为S峰，计算各特性峰与S峰相对保存时间，其相对保存时间应在规定值±5%之内。规定值为：1.00（峰S）、1.06（峰2）、1.35（峰3）、1.99（峰4）、3.20（峰5）。

对照特性图谱
峰1（峰S）：葛根素 峰2：未知 峰3：大豆苷 峰4：染料木苷 峰5：大豆素