RTPCR实验步骤及注意项目.doc
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1、RT-PCR试验时间:-01-0522:32 起源:.com 作者:生物界 RT-PCR试验有三步:抽提RNA,RT,PCR。要求: 1.做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有部分要求,常见500ng或1ug。 2. RT按要求做,通常不会出太大问题。3. PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整cDNA存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能处理。 1)RT和PCR时引物设计是不是一定要先知道目标基因序列?必需在RT时,引物设计有3种方法即a:Random 9mers;b:Oligo dT-Adaptor Primer;和c:特异下游引物。假如用a和b方法
2、,是扩增全部cDNA(理论上),还要用此产物做PCR 模板继续扩增。假如用c方法,那么要去那里查它序列呢? 问题:在做RT-PCR碰到一怪现象,即对同一动物不一样组织扩增同一段基因,结果从一个组织中能够扩出我目标基因,条带很好,而另一组织在一样条件下却得到很多非特异性条带,尝试其它条件一样无法得到满意结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中全部表示,且内参考在两种组织全部可扩增出来)从这两种组织中提取RNA量是不一样,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这相关呢? 请高手指教!解答:1.RT-PCR有两种做法:条件含有话可用kit进行一步法进行;若条件不太好话可分两步进行逆转录再PCR
3、。但以后发觉两步法结果愈加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系愈加单一比较利于PCR进行,当然也可能是我买kit不太好。(promega)。2.RT-PCR应含有条件高质量RNA(保留后可做5,3RACE);引物(最好产物短点);若包含粗略定量话还应考虑RNA浓度或是cDNA浓度(假如由内标分子愈加好,但我发觉其实很不轻易将RNA浓度和内标分子表示量调整完全一样);体系均一性等。3.RACE我做过RACE(3RACE是宝生物Kit;5RACE是Gibico),但现在再进行另一个同源基因3RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来,其中一个已经取得了全序列(RACE方法
4、),而另一个基因3UTR却增么也扩不出来,我推测是不是该基因3UTR太长缘故,我全部快绿了,有没有 RT-PCR常见内标bactin 和GAPDH使用有选择性吗?比如不一样细胞,不一样刺激。 相关内参: RT-PCR内参考能够在一个管子里做(那样也是图好看部分),最好分开两管,把除了引物之外mixture统一配,拍照后,算目标基因和内参比值,这就是基因表示相对浓度。问:我曾经作过同一管PCR,内有actin 和目标基因引物。即使可见到两条均一条带但图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍)。请教mxbdna ,你是怎样处理同一管PCR各成份浓度? 答: it should determined
5、the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using accurate piptte is wrong. it shoud be remembered to do the
6、inner control of housekeeping gene everytime. 在同一管中做RT,其实没有什么问题,不需要taq魅加量,taq酶原来就是过量-,(平时做pcr时候,完全能够再省部分taq酶,半斤八两就能够了,我想这肯定再很多贴子里应该全部谈到了。Mg就跟不能变了,一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。关键是摸,十八摸(太少,只争朝夕,开个玩笑)即使用不着,不过摸上3、5摸总是必需,首先遥分开摸,然后再一起摸,直到摸好了,还要考虑比较不一样模板中量,所以我们不提议再同一管中进行,因为还有相互竞争抑制问题,即使不一样基因之间。相关内参提议: 一定要做内参,每一次,
7、我想。不作内参结果是不可信电泳能够不一起跑,没相关系,计算是相对表示程度,着我在好几封帖子里全部谈了,再说一边我得见解,1、半定量和定量RT-PCR做全部是基因相对表示量,不是绝对表示量,除非你能正确知道来自多少细胞,不过细胞还有死呢。2、以电泳为基础半定量RT-PCR本身是不可信,作为试验粗筛是能够,但不能作为最终止果,3、半定量RT-PCR应该再两管中进行,除非内参基因和目标基因表示相同,长度差不多,GC含量相同,或实在穷要省PCR管和taq。相关平台期和线性期问题,实际上线性期是指数期,只不过恰巧2冥和2倍数是相同。看上去任何一个时期全部能够,实际上是不正确,因为牵涉到酶促动力学问题,这
8、个我也不懂,有部分专门文章,仿佛,包含到很多化学东西。我们学医,也没必需知道那些,不过其中关键是因为模板引物酶原料和buffer之间关系,这种反应单靠改变其中一个成份没有用,酶一直是过量,再加酶也没用,引物ntp全部是这么。烟鬼正传,最好选线性期开始阶段,不过要在你凝胶成像分辨范围内,所以选一个这两种契合点。给你一张图你就明白了,再开始时候酸是切线,这图我在 * 帖过。相关引物设计,再可能情况下,除了常规要求之外,最好兼顾跨内含子(不过,依据要求,还能够专门设计隔内含子,这么还能够用于基因组PCR)、长度小于500bp600bp等等。引物当然要设计成一样退火温度,即使不再一管中,也要一样,要在
9、一台机器里啊。我引物占了冰箱一格,大部分是一个温度,这么任何多个全部能够拿来披,也不用查。我反复说过了,别用软件,就用眼睛看,软件包含在好,有些基因在它出软件时候,还没发觉呢,跟不要说在基因组位置和序列了,怎么考虑内含子问题呢? 18s引物也和著名actin一样是设计,只要拿到序列就能够了,不过限制是只能用总RNA为模板,不过比actin和bubulin等可准多了,更不要说GAPDH这个破烂了。18s除了在细胞中更相同(量)外,关键是它占百分比远远高于看家基因,所以定量愈加正确,我想,不知对不对,请几位主任和eeflying指教。我认为,就像你用某一个东西数量去概括,因该选那种多东西,说一座房
10、子是由块砖造成,比说又29根梁更正确吧。更不要说没有看家基因不看家缺点,因为她是服务于整个基因组表示谱什么。PE有专门用于实时PCR内参试剂盒,就是用18s,不过我们看懂使用那条序列,不知有没有些人用过,通知其序列和genbank号。恰好问一下,我查了部分序列,一直没有去合成,关键是因为手上actin荧光探针还没有完,当初和成了一堆。有那位高手用过18s内参,请问您序列(我指是模板序列)?原位杂交最好用RNA做探针,效果好部分,反正你有钱卖roche盒子,而且量也能确保,因为转录过程嘛,沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也轻易理清。 我认为做RT-PCR方法和条件及应注意事项就是那么几条,很多
11、专业书全部有具体描述,不过很多人还是历经数次磨难,有时就是得不出结果。所以,我认为因为每个人所要克隆片断不一样,引物不相同,所以对不一样人来说还是有她自己特殊性,我以下经历说明:做试验时各人情况不一样,做不出时还是要好好动一下脑子。记得我开始我PCR时,按常规方法,提取总后,首先用自己设计下游引物进行逆转录,不停改变反应条件,进行了次均没有结果。以后考虑到本人克隆PCR片断在我们试验另一位同学克隆片断当中,而该同学已经用RT-PCR克隆出她片断(尽管她用这些产物做模版再进行时也没措施反复出她产物),所以,我先用她引物和条件扩增出她片断,然后用她产物作模板(有点改善,逆转录反应换用了mers随机
12、引物),用我引进物进行通常PCR,最终得到我产物,测序结果完全正确。尽管我这个经历她人很人碰到,但足能够说明试验能够有自己模式,书本知识和她人经验很关键,但有时也不定要受到书本框框和她人经验限制 请问: 1 引物特异退火温度怎样设定?能够依据gc 和at含量算出吗?能够用引物汇报单上Tm值吗? 2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较适宜?MgCl2应加多少?各个成份量有没有确定标准? 3 PCR结果跑电泳,actin有,但跑不出目标条带,有多个原因?和cDNA量少相关吗?Mg离子太多是否会抑制Taqase活性?通常来说引物汇报单伤得是正确,也能够自己算,实际上关键各条引物一致,剩下能够
13、摸. 20中是指体积还是量?只要不显著改变体系离子强度,加1,2ul全部能够.mg要调,但我总认为没有书里讲那么玄乎,我全部是常年不变. 假如内参考有,目标没有,最少证实不是漂亮惹祸.原因书里应该全部说了. 在全部RNA试验中,最关键原因是分离得到全长RNA。而试验失败关键原因是核糖核酸酶(RNA酶)污染。因为RNA酶广泛存在而稳定,通常反应不需要辅助因子。所以RNA制剂中只要存在少许RNA酶就会引发RNA在制备和分析过程中降解,而所制备RNA纯度和完整性又可直接影响RNA分析结果,所以RNA制备和分析操作难度极大。 在试验中,首先要严格控制外源性RNA酶污染;其次要最大程度地抑制内源性RNA
14、酶。RNA酶可耐受多个处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。 外源性RNA酶存在于操作人员手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分子生物学试验中使用RNA酶也会造成污染。这些外源性RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员手及多种试剂。而多种组织和细胞中则含有大量内源性RNA酶。 一、 预防RNA酶污染方法 1. 全部玻璃器皿均应在使用前于180高温下干烤6hr或更长时间。 2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。 3. 有机玻璃电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,
15、然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。 4. 配制溶液应尽可能用0.1% DEPC,在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留DEPC。不能高压灭菌试剂,应该用DEPC处理过无菌双蒸水配制,然后经0.22m滤膜过滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,试验过程中手套要勤换。 6. 设置RNA操作专用试验室,全部器械等应为专用。 二、常见RNA酶抑制剂 1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一个强烈但不根本RNA酶抑制剂。它经过和RNA酶活性基团组氨酸咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶活性。 2. 异硫氰酸胍:现在被认为是最有效RNA酶抑制剂,它在裂解组织同时也使RNA酶失活。它既可破
16、坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈变性作用。 3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶活性。 4. RNA酶蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶一个非竞争性抑制剂,能够和多个RNA酶结合,使其失活。 5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 mRNA分离和纯化真核细胞mRNA分子最显著结构特征是含有5端帽子结构(m7G)和3端Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA3端存在20-30个腺苷酸组成Poly(A)尾,通常见P
17、oly(A+)表示。这种结构为真核mRNA提取,提供了极为方便选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA理论基础就在于此。 mRNA分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。此法利用mRNA 3末端含有Poly(A+)特点,在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异地结合在柱上,当逐步降低盐浓度时或在低盐溶液和蒸馏水情况下,mRNA被洗脱,经过两次寡聚(dT)纤维柱后,即可得到较高纯度mRNA。 寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA 一、试剂准备 13M醋酸钠(pH 5.2) 20.1M NaOH 31上样缓
18、冲液:20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)母液,经高压消毒后按各成份确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65时,加入经65温育(30min)10%SLS至终浓度为0.1%。 4洗脱缓冲液:10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS 5无水乙醇、70%乙醇 6DEPC 二、操作步骤 1将0.5-1.0g寡聚(dT)-纤维悬浮于0.1MNaOH溶液中。 2用DEPC处理1m
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