厌氧性细菌及检验.ppt

厌氧性细菌及检验一定义l有氧条件下不能生长，无氧条件(不是绝对）下才可以生长的一类细菌l1836年Pasteur提出l临床上日益受到重视，60%临床标本存在厌氧菌感染-需要重视二 分类 1 有芽孢厌氧性细菌 一个梭菌属包括83个种 2 无芽孢厌氧性细菌 40多个菌属，300多个菌 种和亚种三 感染l分布l原因l临床症状厌氧菌在正常人体内的分布厌氧菌厌氧菌皮肤皮肤上呼吸道上呼吸道口腔口腔肠道肠道尿道尿道阴阴道道一芽孢菌 G+杆菌 梭状芽孢杆菌属二无芽孢菌（一）G+的杆菌 双歧杆菌（二）G-的杆菌 类杆菌属（三）G+的球菌 消化球菌属（四）G-的球菌 韦荣氏菌属000+000+0+致病的原因l1 组织缺氧或氧化还原电势降低 穿刺伤等封闭性伤口，血管压迫，肿 瘤压迫等等l2 机体免疫力低下临床的症状l1 感染部位产生大量气体，组织脓肿和坏 l 死，皮下有捻发音，是产气夹膜梭菌感l 染的特征l2分泌物有恶臭，或为暗红色，分泌物涂 l 片经革兰氏染色，发现细菌，而培养阴 l 性的l3 其它等等厌氧菌标本的采集和送检l标本的采集和送检-1 标本决不能被正常菌群污染；2 应尽量避免空气标本的采集标本来源收集的方法封闭性脓肿妇女生殖道下呼吸道分泌物胸腔窦道，子宫腔，深部创伤组织尿道针管抽取后穹隆穿刺抽取肺穿刺术胸腔穿刺术静脉注射的塑料导管穿入无菌外科切开上阴部膀胱穿刺标本的送运与处理l针筒送运法l无菌小瓶送运法l棉拭送运法l大量标本送运法l组织块送运法l厌氧袋送运法分离和鉴定检验的方法l1 直接镜检 一些特殊的特点，临床工作中的总结 可对初步判断及临床应用做早一步的 指 导作用2 分离培养l1 初步培养l1）培养基的选择l 强化血琼脂平板l 卡那万古霉素冻溶血琼脂平板l 七叶苷胆汁平板等等l2）标本的接种l 每份标本应接种3个培养平板，分别放置于有氧，无氧和含5%10%的CO2的容器中，有时需要专用的培养基l3）厌氧培养法l a 厌氧罐培养法l b 气袋法l c 气体喷射法l d 厌氧手套箱法l e 其它等等l2 次代培养和厌氧菌的确定l3 分离培养中可能失败的原因 1）培养前为做标本的直接涂片和染色镜检 2）标本在空气中放置太久或接种时时间过长 3）未用新鲜配制的培养基l4）未用选择性培养基l5）无合适的厌氧罐或装备出现问题l6）培养时间不足l7）.鉴定实验 l1 形态和染色l 重要的是为下一步的鉴定提供参考，l时间 l 破伤风梭菌革兰氏染色改变l拉丝实验 加KOH30g/l一滴，能拉丝为阴性不能为阳性lPH l 痤疮丙酸杆菌7.0时阴性及多型性l 6.0及以下革兰氏阳性杆菌 l2 菌落性状l 1）色素 产黑色素类杆菌210天可产生黑色素；溶齿放线菌培养34天产生粉红色色素l 2）溶血 产气夹膜梭菌在新鲜的血琼脂平板上可产生双溶血环l 3）荧光 l3 抗生素敏感实验l4一些特殊的敏感实验 l 聚茴香脑磺酸 钠敏感实验l5生化特性l6气液相色扑l7 PCR等等有芽孢的厌氧菌l简介 梭菌属 G+陈旧性培养基G-四 破伤风梭菌l大量存在于人和动物的肠道l粪便污染l伤口被污染导致-注意消毒清洁l芽孢为于顶部，呈鼓槌壮，直径比菌体粗，呈梭状l可以被用来生物技术，l外毒素致毒一）生物学性状 染色，培养 生化 对我们实验诊断来说最重要l破伤风梭菌菌体细长，长48um，宽0.3 0.5um，周身鞭毛，芽胞呈圆形，位于菌体顶端，直径比菌体宽大，似鼓槌状，是本菌形态上的特征。繁殖体为革兰氏阳性，带上芽胞的菌体易转为革兰氏阴性。破伤风梭菌为专性厌氧菌，最适生长温度为37pH7.07.5，l营养要求不高，在普通琼脂平板上培养2448小时后，可形成直径1mm 以上不规则的菌落，中心紧密，周边疏松，似羽毛状菌落，易在培养基表面迁徒扩散。在血液琼脂平板上有明显溶血环，在疱肉培养基中培养，肉汤浑浊，肉渣部分被消化，微变黑，产生气体，生成甲基硫醇（有腐败臭味）及硫化氢。l一般不发酵糖类，能液化明胶，产生硫化氢，形成吲哚，不能还原硝酸盐为亚硝酸盐。对蛋白质有微弱消化作用。本菌繁殖体抵抗力与其他细菌相似，但芽胞抵抗力强大。在土壤中可存活数十年，能耐煮沸4050分钟。对青霉素敏感，磺胺类有抑菌作用。二）致病性与免疫性l破伤风梭菌芽胞广泛分布于自然界中可由伤口侵入人体，发芽繁殖而致病，但破伤风梭菌是厌氧菌，在一般伤口中不能生长，伤口的厌氧环境是破伤风梭菌感染的重要条件。窄而深的伤口（如剌伤），有泥土或异物污染，或大面积创伤、烧伤、坏死组织多，局部组织缺血或同时有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染，均易造成厌氧环境，局部氧化还原电势降低。有利于破伤风杆菌生长l破伤风梭菌能产生强烈的外毒素，即破伤风痉挛毒素（Tetanospasmin）或称神经毒素(Neurotoxin)。破伤风毒痉挛毒素是一种神经毒素，为蛋白质，由十余种氨基酸组成不耐热，可被肠道蛋白酶破坏，故口服毒素不起作用。在菌体内的痉挛毒素是单一和一条多肽链，分子量15万。破伤风毒素的毒性非常强烈，仅次于肉毒毒素。破伤风梭菌没有侵袭力三）微生物学检验l标本采集l检验程序l检验方法和鉴定五 气性坏疽病原菌l以组织坏死，水肿，产气及全身中毒的严重的急性外伤感染l包括很多-重点 产气夹膜梭菌产气夹膜梭菌产气夹膜梭菌l生物学性状l 形态和染色l 培养特性l 生化反应l致病性l为革兰氏阳性粗大梭菌，3411.5um。单独或成双排列，有时也可成短链排列。芽胞呈卵圆形，芽胞宽度不比菌体大，位于中央或末次端。培养时芽胞少见，须在无糖培养基中才能生成芽胞。在脓汁、坏死组织或感染动物脏器的涂片上，可见有明显的荚膜，无鞭毛，不能运动。l厌氧程度不如破伤风梭菌要求高。在血液琼脂平板上菌落较大、灰白色、不透明，边缘呈锯齿状，多数菌株有双层溶血环，内环是毒素的作用，而外环不完全溶血是a毒素所致。不能消化已凝固的蛋白质和血清。l在疱肉培养基中肉渣不被消化，有时呈肉红色。在牛乳培养基中能分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，同时生成大量气体，将凝固的酪蛋白冲成海棉状碎块。管内气体常将覆盖在液体上的凡士林层向上推挤，这种现象称为“汹涌发酵”，是本菌的特点之一。l能分解多种糖类，如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖，产酸产气，不发酵甘露糖或水杨苷，能液化明胶，产生硫化氢，l致病条件与破伤风梭菌相似。产气荚膜梭菌既能产生强烈的外毒素，又有多种侵袭性酶，并有荚膜，构成其强大的侵袭力，引起感染致病。l1气性坏疽l2食物中毒l3急性坏死性肠炎l1直接涂片镜检 从伤口深部取材涂片，革兰氏染色镜检，可见革兰氏阳性大杆菌，并有荚膜，常伴有其他杂菌，白细胞甚少，形态不规则，这是气性坏疽标本涂片的特点。l2分离培养与鉴定 取坏死组织制成悬液，接种于血球脂平板上或疱肉培养基中，厌氧培养，观察生长情况。取细菌培养物涂片镜检，并进一步用生化反应鉴定。l3动物实验 取培养液0.51ml给小鼠或家兔静脉内注射，10分钟后杀死动物，置3758小时。如动物躯体膨胀，即行解剖，可见脏器和肌肉内有大量气泡，尤以肝脏最为明显，称“泡沫肝”。取内脏或心血涂片镜检或分离培养，可发现有革兰氏阳性大杆菌，并有明显荚膜。无芽孢的厌氧菌l革兰氏阴性的杆菌l革兰氏阳性的杆菌l革兰氏阴性的球菌l革兰氏阳性的球菌革兰氏阴性的杆菌 -正常菌群的组成部分正常菌群的组成部分 l类杆菌属致病性球菌l葡萄球菌属 金黄色葡萄球菌l 表皮葡萄球菌l链球菌属 链球菌l 肺炎链球菌l奈瑟菌属 脑膜炎奈瑟菌l 淋病奈瑟菌 肺炎链球菌(S.pneumoniae)属链球菌科，链球菌属。广泛分布于自然界，主要寄生于人类上呼吸道，多数不致病。一、生物学性状l1形态结构l2培养特性l3生化反应 l4抗原结构l5抵抗力特点 l6.变异性1.形态结构lG+，呈矛尖状，成双排列，标本或液体培养中成链状。l有荚膜，无鞭毛，不形成芽胞。2.培养特性l 营养要求较高，含血液或血清的培养基中生长。l 兼性厌氧，C02 5-10%生长最好。l溶血性菌落周围有草绿色溶血环。l 液体培养基中培养24h，呈均匀混浊，后期因产生自溶而变得澄清 3生化反应 l可分解多种糖类，产酸不产气。l胆汁溶解试验阳性：加入胆汁或10%去氧胆酸钠，37.，5-10min，激活本菌的自溶酶，出现溶菌现象。lOptochin敏感试验阳性：单个菌落涂于血平板上，用optochin纸片贴于接种区中央，35需氧培养过夜，抑菌圈 18mm。4抗原结构l 荚膜多糖抗原：多糖抗原，型特异性，共85型，型引起大叶性肺炎。l菌体种属特异性抗原：多糖抗原，存在于细胞壁，称C多糖。在钙离子存在时,C多糖可与正常人 血 清 中 称 为 C-反 应 蛋 白(C reactive protein,CRP)的球蛋白结合，发生沉淀。5抵抗力特点 较弱，加热56，20min即死亡。对一般消毒剂敏感，对干燥抵抗力较强。6.变异性 l荚膜变异：有荚的光滑（S）型菌有毒力，失去荚膜的粗糙（R）型毒力减低或消失。l20、把小鼠随机分成两组，进行肺炎球菌荚膜形成试验，分别将两株细菌接种于不同组动物腹腔（每组接种一株细菌）。12小时后杀死小鼠解剖，取腹腔作荚膜染色试验。结果有一组只有少量细菌，且未见荚膜主要原因是什么？lA、动物对细菌不敏感 B、染色试剂不合标准 C、细菌毒力发生了变异lD、采标本时间过早二、致病性1致病物质2所致疾病1.致病物质l荚膜：肺炎球菌的致病力，主要是荚膜的抗吞噬作用。l溶血毒素“O”：自溶后释放，能溶解人和动物的红细胞，高浓度对动物有坏死及致死作用。2.所致疾病 l存在于正常人上呼吸道。l仅在人体抵抗力下降时才引起疾病。如大叶性肺炎，支气管炎等。三、微生物学检验(一)标本采集 痰、脓液、血液等。(二)检验方法及鉴定 1.直接涂片 革兰氏色染色，荚膜染色2.分离培养。胆汁溶菌试验。菊糖发酵。Optochin试验。与草绿色链球菌鉴别3.小鼠毒力试验 有毒力的菌株，接种后12-36h，死亡。第四节 奈瑟菌属（neisseria）l 为一群G-双球菌，严格寄生菌，人是自然宿主l 主 要 致 病 菌 是 脑 膜 炎 球 菌(merningococcus)和 淋 病 球 菌(gonorrhoeae)一、脑膜炎球菌即脑膜炎奈瑟菌，是流行性脑脊髓膜炎的病原体（一）、生物学性状l1形态结构l2培养特性l3生化反应l4.抗原结构l5.抵抗力特点1形态结构lG-，肾形成双排列l在患者脑脊液标本中位于中性粒细胞内l无芽胞、无鞭毛，具有荚膜、菌毛。2培养特性l营养要求高，必须在含有血清或多种氨基酸、无机盐的培养基上生长良好。l血平板：半透明，灰褐色，圆形，湿润光滑露滴样菌落。l易自溶。l巧克力平板，蓝灰色，半透明，光滑湿润的菌落。l卵黄双抗（EPV）平板：为无色，光滑湿润的菌落。l血清肉汤：呈微混浊。3.生化反应l分解葡萄糖、麦芽糖l硝酸盐还原反应阴性，不分解尿素l氧化酶试验阳性4.抗原结构l可分9个血清群，对人致病的主要试A群5抵抗力特点l对寒冷、光、热力，干燥等十分敏感。室温3h，60 5min死亡。l采集标本：注意保温迅速送检。l对磺胺类、青霉素、链霉素均敏感。l12、对脑膜炎奈瑟氏菌的标本采送，哪一种是错误的？l A、低温 B、保温l C、防干燥 D、快速（二）、致病性与免疫性l1致病物质l2所致疾病l3.免疫性1.致病物质：内毒素、荚膜，菌毛2.所致疾病：寄生在正常人鼻咽部，存在易患人群，与患者补体介导的杀菌活性缺陷有关。约2%-3%的人表现为流脑症状l3.免疫性：病原可产生群特异性抗体，但不持久。(三)微生物学检验 1标本采集 l 菌血症期病人采集血液l 有出血点或瘀斑者，可取瘀斑渗出液l 有脑膜刺激症状，抽取脑脊液 2检验方法直接涂片检查 脑脊液或瘀斑渗出液，干燥固定后革兰染色，若发现G-双球菌，呈肾形成对，可初报分离培养鉴定l 过氧化酶试验：阳性l 触酶试验：阴性l 血清凝集试验：阳性