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毕赤酵母表达实验手册
大肠杆菌表达系统最突出长处是工艺简朴、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需通过翻译后修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才干转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不合用于表达构造复杂蛋白质。此外，蛋白质活性还依赖于形成对的二硫键并折叠成高档构造，在大肠杆菌中表达蛋白质往往不能进行对的折叠，是以包括体状态存在。包括体形成虽然简化了产物纯化，但不利于产物活性，为了得到有活性蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同步增长了成本。
与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具备细胞生长快，易于培养，遗传操作简朴等原核生物特点，又具备真核生物时表达蛋白质进行对的加工，修饰，合理空间折叠等功能，非常有助于真核基因表达，能有效克服大肠杆菌系统缺少蛋白翻泽后加工、修饰局限性。因而酵母表达系统受到越来越多注重和运用。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟基因工程表达系统，当前已商业化基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达，其重要长处是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具备真核生物基因表达调控机制和蛋白质加工修饰能力，其产物往住形成没有活性包涵体，需要通过变性、复性等解决，才干应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起注重，主更是由于酵母是单细胞真核生物，不但具备大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产特点，还具备真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具备比较完备基因表达调控机制和对表达产物加工修饰能力，人们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面结识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达酵母宿主．1981年酿酒酵母表达了第一种外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。虽然干扰素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大某些表达由实验室扩展到工业规模时，培养基中维特质粒高拷贝数选取压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因高效表达需要高拷贝数维特，因而引起产量下降。同步，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模可以接受培养基时，往往导致产量下降。为克服酿酒酵母局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表第二代酵母表达系统［2］。
甲基营养型酵母涉及：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛，已运用此系统表达了一系列有重要生物学活性蛋自质。毕赤酵母系统广泛应用，因素在于该系统除了具备普通酵母所具备特点外，尚有如下几种长处［1、2、3］；
⑴ 具备醇氧化酶AOX1基因启动子，这是当前最强，调控机理最严格启动子之一。
⑵ 表达质粒能在基因组特定位点以单拷贝或多拷贝形式稳定整合。（即同源重组）
⑶ 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。
⑷ 毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达蛋白贮存其中，可免受蛋白酶降解，并且减少对细胞毒害作用。
Pichia.pastoris基因表达系统通过近十年发展，已基本成为较完善外源基因表达系统，具备易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并恰当糖基化，培养以便经济等特点。运用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素 C片段、基因工程抗体等各种外源基因，证明该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特性外源基因表达系统，并且非常适当子扩大为工业规模［4］。当前美国FDA已能评价来自该系统基因工程产品，近来来自该系统Cephelon制剂已获得FDA批准，因此该系统被以为是安全． Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要作用，增进更多外源基因在该系统高效表达，提供更为广泛基因工程产品［2、3］。
近年来，Invitrogon公司开发了毕赤酵母表达系统系列产品，短短几年已有300各种外源蛋自在该系统得到有效表达，被以为是当前最有效酵母表达系统。
毕赤酵母宿主菌惯用有GS115和KM71两种，都具备HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具备AOX1基因，是Mut＋，即甲醇运用正常型；而KM71菌株AOX1位点被ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇运用缓慢型，两种菌株都合用于普通酵母转化办法。
Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，因此表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因表达［5］．涉及启动子、外源基因克隆位点、终结序列、筛选标记等。表达载体都是穿梭质粒，先在大肠杆菌复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞。为使产物分泌胞外，表达载体还需带有信号肽序列。
毕赤酵母表达系统有各种分泌型表达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效分泌表达。胞外表达需要在外源蛋白N末端加上一段信号肽序列，引导重组蛋白进入分泌途径，可使蛋白蛋白质在分泌到胞外之后获得精确构型。毕赤酵母对外源蛋白自身信号序列辨认能力差，在本实验中所使用pPICZαA质粒，其信号肽来自酿酒酵母α-交配因子（α-factor），能较好达到以上规定。并且作为新一代毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一种特点是其具备Zeocin抗性标记基因，给咱们筛选转化子工作带来很大便利［1、2］。
pPICZαA质粒是作为新一代毕赤酵母分泌表达质粒，它重要特点简介如下：
⑴ 具备强效可调控启动子AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶）；
⑵ 具备Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选，即在YPDZ平板上生长转化子中，100％均有外源基因整合，大大简化了重组转化酵母筛选过程［5］。在操作过程中，Zeocin也可用来筛选含表达载体pPICZαA大肠杆菌转化子，不必此外使用Amp，经济而又简便；。
⑶ 在表达载体A0X1 5’端启动子序列下游，有供外源基因插入多克隆位点，多克隆位点下游有A0X1 3’端终结序列；
⑷ 分泌效率强信号肽α-factor.
Invitrogen公司开发毕赤酵母表达系统系列产品作为当前被应用为最为广泛酵母表达系统，其重要长处有：醇氧化酶可调控强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高。外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在。同步，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工解决，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白活性，并且，有助于产物纯化。
一．毕赤酵母表达惯用溶液及缓冲液配制
1．1 各种母液配制
10*YNB   （具有硫酸铵、无氨基酸13.4%酵母基本氮源培养基） 4℃保存。34g酵母基本氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。
500*B     （0.02%生物素 Biotin）  4℃保存 保存期为1年。20mg生物素溶于100ml水中，过滤除菌。
100*H     （0.4%Histidine 组氨酸） 4℃保存 保存期为1年。400mgL-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以增进溶解），过滤除菌。
10*D       （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期为1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。

10*M       （5%Methanol  甲醇）   保存期为2个月。将5ml甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。
10*GY      （10%Glycerol  甘油） 保存期为1年以上。将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。
100*AA      （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）  4℃保存 保存期为1年。分别将500mgL-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。
1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将1mol/LK2HPO4溶液132ml与1mol/LKH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。
1.2 惯用溶液及缓冲夜
1.2.1 碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液：
 溶液Ⅰ：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA，25mmol / L Tris－HCI (pH 8.0)
溶液Ⅱ：0.2mol／L NaOH，1％ SDS（临用时配制）
溶液Ⅲ：29.44g KAc，11.5ml Acetic acid，加ddH2O至100 ml。
4℃保存。
1.2.2 10% 甘油 （Glycerol）：
将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。保存期为1年以上。
1.2.3  Rnase-H2O：
1ul Rnase 加入1ml 灭菌 dd H2O。4℃保存。
1.2.4  TE缓冲液：
10mmol / Tris-CI（pH 8．0）， lmmol / L  EDTA（pH 8.0）
1.2.5  STE缓冲液：
0.1mol / L,  10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0)，1mmol / L EDTA (pH 8.0)
1.2.6  SCE缓冲液：
1mol / L Sorbitol (山梨醇)，10mmol / L 柠檬酸钠 ， 10mmol / L EDTA
1.2.7  1M potassium phosphate buffer （pH 6.0）：
     132 ml 1M  K2HPO4
     868 ml 1M  KH2PO4
1.2.8 50X TAE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液，pH 8.0（1L）：
      242 g   Tris
      57.1 ml   Acetic Acid
      37.2 g   EDTA
二．毕赤酵母表达培养基配制［5］
2.1  LB（Luria－Bertani）培养基：  
Trypton        l％
                              Yeast Extract   0.5％
                              NaCl          l％
                              PH 7.0
制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。
2.2  LLB（Low Salt LB）培养基：  
  Trypton        l％
                              Yeast Extract   0.5％
                              NaCl        0.5％
                              PH 7.0
制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。
2.3  YPD （又称YEPD）
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）

Trypton            2%
dextrose (glucose)    2%
+agar              2%
+Zeocin       100 µg/ml
液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几种月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4  YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：
yeast extract        1%
peptone            2%
dextrose (glucose)    2%
sorbitol            1 M
+agar              2%
+ Zeocin         100 µg/ml
不论是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必要存储4℃条件下，有效期1～2周。
2.5  MGY
Minimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）
（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将800ml灭菌水、100ml10*YNB母液、2ml500*B母液和100ml10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。
2.6  MGYH
Minimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸）
在1000mlMGY培养基中加入10ml100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。
2.7  RD
Regeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）
（具有：1mol/L山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）
1. 将186g山梨醇定容至700ml，高压灭菌；
2. 冷却后于45℃水浴；
3. 将100ml10*D、100ml10*YNB；2ml500*B；10ml100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45℃后，与环节2山梨醇溶液混合。4℃保存。
2.8  RDH
Regeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸）
在RD培养基配制第三步中，在加入10ml100*H母液，同步无菌水体积减少至78ml即可，别的配制办法与RD相似。4℃保存。
2.9  RD及RDH平板制备
1. 将186g山梨醇和15~20g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；
2. 参照RD/RDH液体培养基配制环节4，将100ml10*D、100ml10*YNB；2ml500*B；10ml100*AA等母液、（10ml100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与环节1山梨醇/琼脂液混匀；
3. 迅速制备平板。4℃可保存数月。
2.10  RD及RDH TOP 琼脂制备（惯用于酵母菌包被）
1.将186g山梨醇和7.5~10g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；
2.参照RD/RDH液体培养基配制环节4，将100ml10*D、100ml10*YNB；2ml500*B；10ml100*AA等母液、（10ml100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与环节1山梨醇/琼脂液混匀；
3.将该TOP琼脂置于45℃水浴冷却、保温，备用。
2.11  MD与MDH
Minimal Dextrose Medium +（Histidine）  最小葡萄糖培养基 +（ 0.004 %组氨酸）
（具有：1.34%YNB；；4*10-5% 生物素；2%葡萄糖）
1. 100ml10*YNB；2ml500*B和100ml10*D母液，用800ml无菌水定容至1000ml即可；
2. 如配制MDH，可在上述MD中加入10ml100*H即可；
3. 如配制平板，可无菌水灭菌前，加入15~20g琼脂。4℃可保存数月。
2.12  SOC培养基：
                         Trypton               l％
                             Yeast Extract         0.5％
                             NaCl                  0.05％
                             Glucose (1mol / L)     2%
121℃高压灭菌 20min，冷却后，4℃保存
三．重要实验环节操作
3.1 酵母菌株分离纯化
    接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长单菌落划YPD平板，4℃保存。
3.2 pPICZαA原核宿主菌TOP10F’活化培养
TOP10F’做为菌种保存在－70 ℃条件下，在进行扩大培养抽提质粒之前，先要进行活化培养。
接种TOP10F’于5ml LLB（加入25ug / ml Zeocin）中，37℃，200 rpm ，培养16～18小时。
3.3毕赤酵母表达实验办法
3.3.1线状质粒DNA脱磷酸化解决
    为了防止载体质粒DNA自身环化，用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）解决酶切后质粒DNA，详细操作如下：
⑴ 建立反映体系：
线性化质粒                                35ul
    10x CIP buffer                                4ul
     CIP                                           1ul
     ddH2O                                          5ul
    ——————————————————————————
total                                        45ul
⑵ 在PCR仪上控制反映温度（加石蜡油封闭），37℃，15 min ；50℃，15 min；56℃，30 min（灭活）。
⑶ 在56℃未开始前停止，加入proteinse K ，用于灭活CIP，加入试剂如下：
反映物                 45ul
10x 5％ SDS               7ul
 10x EDTA （pH 8.0）       7ul
 proteinse K               5ul
 ddH2O               6ul         
———————————————————
  total               70ul
⑷ 纯化使用QIAquick spin kit ，按照2.2.3.3环节进行，20 ul 灭菌ddH2O洗脱纯化产物。进行1％琼脂糖凝胶电泳，120 V， 观测纯化成果，并大概预计DNA浓度。
3.3.2  E.coli TOP10F’ 感受态细胞制备及转化
⑴ 取10 ul TOP10F’ 菌液，接种于 200ml LB液体培养基中活化培养，37℃ ，200 rpm，16～18小时。取100 ul菌液接种于 200 ml 液体LB培养基中。
⑵ 37℃ ，200 rpm，培养16～18小时。
⑶ 灭菌500 ml 离心管，4℃，4000 rpm，20 min 。得菌体沉淀。弃上清，菌体用10％甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。
⑷ 第三次离心后，弃绝大某些上清，留下约1ml 液体用于重悬菌体。
⑸ 从制得感受态细胞中，取200 ul于灭菌EP管中，加入连接反映产物 5ul ，混匀，不要产气愤泡，在冰上放置 5 min。
⑹ 将混匀后得200ul菌液移入电击杯中。
⑺ 使用电击穿孔仪进行转化，设立为 电压 2500 V，时间 5 ms。
⑻ 电击后，往电击杯中加入 800ul SOC培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，轻摇45～60 min。
⑼ 取所有均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml LLB－Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流动，37℃ 培养12～16小时。
*注：设空载体做对照。
3.4  毕赤酵母电转化办法
3.4.1 菌体准备：
1. 挑取酵母单菌落，接种至具有5ml YPD培养基50ml三角瓶中，30℃、250~300r/min培养过夜；
2. 取100~500µl培养物接种至具有500ml新鲜培养基2L三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，至OD600达到1.3~1.5；
3. 将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml冰预冷无菌水将菌体沉淀重悬；
4. 按环节3离心，用250ml冰预冷无菌水将菌体沉淀重悬；
5. 按环节3离心，用20ml冰预冷1mol山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
6. 按环节3离心，用1ml冰预冷1mol山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；
7. 备注：可将其分装为80µl一份包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周之内）。
3.4.2 电击转化：
8. 将5~20µg线性化DNA溶解在5~10µl TE溶液中，与80µl上述环节6所得菌体混匀，转至0.2cm冰预冷电转化杯中；
9. 将电转化杯冰浴5min；
10. 依照电转化仪提供资料，参照其她文献及多次摸索，拟定适当电压、电流、电容等参数，按优化参数，进行电击；
11. 电击完毕后，加入1ml冰预冷山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mlEP管中；
12. 将菌体悬液涂布于MD或RDB平板上，每200~600µl涂布一块平板；
13. 将平板置于30℃培养，直至单个菌落浮现。
推荐：电压1.5kV；电容25µF；电阻200Ω。电击时间为4～10msec。
3.5  Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子办法
3.5.1  模板解决：
1. 平板上菌落长到肉眼可见时（约12小时）；
2. 将除了模板之外其他PCR反映液组分准备好，并分装。引物最佳使用Kit中已有检测专用引物，或者一条使用载体上引物，一条使用基因特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆方向）；
3. 用半根灭菌牙签（节约，并且好用）挑取菌落，在PCR管中涮如下，放入一种灭菌1.5毫升离心管，对PCR管和1.5毫升离心管编号；
4. PCR扩增，1％ agarose电泳；
5. 对于PCR扩增显现特异性条带克隆，把置于1.5毫升离心管中半截牙签扔到5毫升YPDZ培养基中，30度培养，8－12小时后提质粒，酶切鉴定确认。
注意：本实验办法应用在需要挑取克隆较多（也就是克隆效率低），使用PCR初筛可以使工作量大为减少。
3.5.2 PCR反映体系：
   以TaKaRa Taq DNA聚合酶反映为例：
组分 50μl体系 20μl体系
10xReaction Buffer 5.0μl 2.0μl
25mmol/L MgCl2 3.0μl 1.2μl
2.5mmol/L dNTPs 5.0μl 3.0μl
Primer 1（10μmol/L） 2.5μl 1.0μl
Primer 2（10μmol/L） 2.5μl 1.0μl
ddH2O 31.5μl 12.6μl
Taq DNA聚合酶 0.5μl 0.2μl
TOTAL 50.0μl 20.0μl
3.5.3 PCR反映条件：
初始变性 94℃  4min 
变性 94℃  30s 34个循环
退火 50~54℃ 30s 
延伸 72℃  30s 
结束延伸 72℃ 10min 
保存 4℃ 
3.6 毕赤酵母基因组提取办法
⑴ 接种重组和空质粒转化子于5ml YPDZ培养基， GS115菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16～18小时。
⑵ 室温下，1500 g离心5-10min收集菌体
⑶ 100 ulTE（pH 7.0）重悬，加入300 ul EDTA（pH 8.0），0.07M Tris－HCl，3 ulβ-巯基乙醇，1ul Lyticase ，37℃水浴30 min。
⑷ 10000g离心5~10min，取沉淀，加90ul TE重悬。
⑸ 200ul 饱和酚，200ul氯仿，混匀，离心30s ，取上层水相。
⑹ 加入两倍体积无水乙醇以及1/10体积NaAC，-20℃放置30min；
⑺ 10000g离心20min，弃上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；
⑻ 干燥后，加入15 µlTE或H2O溶解，-20℃备用。
3.7 Mut+表型重组酵母诱导表达实验
1. 挑选一单菌落，置于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基250ml摇瓶中，于28-30°C/250-300 rpm培养至OD600 = 2-6 (~16-18 h)；
2. 室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用MM、BMM或 BMMY重悬菌体，使OD600 =1.0左右（约100~200ml）；
3. 将环节2所得菌液置于1L摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300 rpm摇床上继续生长；
4. 每24h向培养基中添加100％ 甲醇至终浓度为0.5～1.0%；
5. 准时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目蛋白表达量和菌液最佳收获时间。时间点普通取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；
6. 对分泌表达，分离样品上清液；对胞内表达，分离样品菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；
7. 可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白表达。
3.7 Muts表型重组酵母诱导表达实验
1. 挑选一单菌落，置于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基250ml摇瓶中，于28-30°C/250-300 rpm培养至OD600 = 2-6 (~16-18 h)；
2. 室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积MM、BMM或 BMMY重悬菌体（约10~20ml）；
3. 将环节2所得菌液置于100ml摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300 rpm摇床上继续生长；
4. 每24h向培养基中添加100％ 甲醇至终浓度为0.5～1.0%；
5. 准时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目蛋白表达量和菌液最佳收获时间。时间点普通取：0、24、48、72、96和120h；
6. 对分泌表达，分离样品上清液；对胞内表达，分离样品菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；
7. 可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白表达。

四 实验注意事项
4.1信号肽辨认位点设计
   以质粒pPICZαA为例。在运用PCR反映在外源基因两端引入酶切位点实验中。如果质粒pPICZαA双酶切中丢失了KEX2蛋白酶酶切位点Lys－Arg，应当在上游中，增长了编码Lys、Arg密码子AAA、AGA 。酵母细胞膜中中KEX2蛋白酶是α-factor信号肽切割酶，它能有效辨认酶切位点Lys－Arg，通过对信号肽切割使基因表达产物释放至胞外。
4.2 PCR产物酶切保护碱基设计
    运用PCR转换酶切位点，通过P3、P4两引物扩增在rhEGF两端加上XhoⅠ、XbaⅠ辨认位点和5个保护碱基。
依照限制性核酸内切酶工作原理，内切酶一方面需要结合到核苷酸序列上，并在上面进行滑行，直至辨认到酶切位点，为了能使内切酶有效结合到序列上以利于其有效加工。在运用PCR进行酶切位点转换时候，普通应在5'端限制酶位点外再加3个保护碱基GC［6］，防止引物合成中由于合成效率和纯化问题而导致酶切位点残缺。
核苷酸保护碱基之为了保证限制型内切酶工作效率，在其辨认位点两侧应当保证一定旁侧序列，换言之，辨认位点是限制型内切酶辨认并特异性切割底物必要而不充分条件。鉴于NEB(New England Biolabs)公司在限制酶领域总体研究水平和对保护碱基方面独到理解，在设计引物时可以参照NEB公司产品目录背面附录：Cleavage to the end of DNA fragments进行［7］，但是，某些不惯用酶或虽有推荐保护碱基序列但酶切效率仍不高酶还是很难设计保护碱基。本次实验中，依照美国基因动力实验室文献报道［8］；XbaI、NheI和SpeI位点5’端保护碱基须在5个左右才容易被酶切割，以及某些前人经验总结，咱们在设计引物时在辨认位点5’端，设计了5个保护碱基。以保证较高酶切效率。
4.3高保真DNA聚合酶使用
  Vent DNA聚合酶是从高温嗜热菌中分高出高保真（High Fidelity）耐高温 DNA聚合酶，能纠正 DNA扩增中产生错误，而老式Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶及其变体 AmpliTaq，KlenTaq等都无3’至5’纠错功能，因而在扩增时浮现碱基错配机率为 2.1x104。这对于大批量PCR产物而言，并不是十分严重问题，由于又同样错误DNA分子仅占所有合成DNA分子群体很少一某些。但是，如果PCR扩增DNA片段是用于分子克隆，那么这就是件值得注重事情，由于此种分子具有一种或数个错误掺入核苷酸，那么在该克隆中所有克隆DNA都将带有同样“突变”。将会导致严重后果［9］。
具备校正功能 DNA聚合酶尚有Pfu，Deep Vent，Pwo，UlTma等，Pfu是其中出错率最低，比Taq DNA聚合酶低10倍。在本论文中，为了减少hEGF 在 PCR过程错误扩增，在人工合成hEGF过程中使用了Vent DNA聚合酶。
随着PCR技术不断发展成熟（扩增长度、保证性、产量和特异性等），质粒构建过程大多数细胞内DNA复制将被PCR这一细胞外DNA复制所代替，质粒构建效率将有质奔腾。
4.4密码子偏好性原则
    酵母菌对外源基因表达也和外源基因密码子选用关于。理解表达系统宿主在密码子使用上偏爱性对从翻译水平分析外源基因表达规律有重要意义,也为改造外源基因或改造宿主细胞提供根据［10、11］。
4.5线性化及采用电转化因素：
在pPICZαA-EGF电转整合入GS115时候，由于需要比较高转染率，咱们对其用限制性内切酶SacⅠ进行线性化解决。
细菌内同源重组被以为是重组质粒构建过程难点。由于未线性化环状质粒之间发生同源重组几率非常低，因此重组转移载体必要用特定限制性内切酶进行线性化解决。这种解决目：
⑴ 防止随机插入重组时质粒在功能区断开，导致目基因表达失活；
⑵ 让同源重组以指定方式发生。
4.5 乙醇沉淀法问题
重要环节如下：
1）酶切体系（80ul）中2倍体积无水乙醇加1/10体积PH5.2 NaAC，混匀
2)-20℃ 20分钟沉淀
3)13200rpm，20min，离心后弃上清
4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清
5)37度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床出风口吹出暖风吹）。
6)20ul ddH2O重溶
如果想提高转化效率，可以稍微做某些改进：
1. 还是用酚抽一下，去除内切酶；
2. 75%乙醇应洗两遍，尽量去除盐离子，防止电转化杯被击穿，同步可提高效率；
3. 在沉淀时，如用终浓度2.5M醋酸钠+2.5倍体积无水乙醇，可沉淀几乎所有DNA，但需要用75%乙醇认真洗两遍。
4.6 酶切总结
影响重组质粒构建效率最核心环节在于酶切，不论与否是定向克隆还是非定向克隆。酶切核心在于切干净，彻底酶切反映是成功一半，特别是载体酶切，特别是双酶切。
双酶切普通是先反映低盐buffer、后反映高盐buffer，如果低盐buffer酶在高盐buffer酶反映条件下有低活性（普通来讲在NEB手册上均有标示），最佳就先纯化（酚/氯仿抽提、乙醇沉淀）过，再进行第二次酶切反映。注意：有相似功能（如：切同一序列，并产生相似末端）酶，不一定是相似酶（构造、性质不同）。
双酶切失败有诸多因素，先要看你抽质粒有无问题，你可以用2—3种拟定单酶切酶分别切质粒，如果都只有一条带就没问题；
再看你双酶切缓冲液是不是适当，如果你双酶切条件不对，就会有大小不同片断。有时候提供应你缓冲液理论值与实际有很大差别。建议你回头检查一下你质粒超螺旋是不是较好，酶切实在不行话，就分开来切，顺便检查你那一种酶，或者那一种酶切有问题。抽提质粒要注意溶液Ⅱ‏解决时间不要超过5分钟，太长会有某些质粒不能复性，并且酶切不动。
酶切反映成功前提是对质粒载体大体定量，太多载体用量对酶切效率有负面影响，而太少质粒载体不能保证明验需要。
4.7 如何减少PCR反映中引物二聚体
减少引物形成二聚体也许性：
 1.退火温度设立不对，导致引物与模板结合率减少。
 2.引物设计不好，很容易形成二聚体。
 如果遇到这种状况，可以尝试从如下几种方面解决：
①设计引物时候
一方面要熟悉引物设计普通原理，参照某些资料，积累经验。如果条件容许话，可以用比较靠得住引物设计软件验证我引物，如果没问题，则进行下一步。
②变化退火温度
普通引物合成后厂家会提供其Tm值，可以依照这个温度为基准来做温度实验。如果你设计引物里头有酶切位点和保护碱基，则此办法不行，可以用比较靠得住引物设计软件来计算你引物中与模板结合某些Tm值，然后以此为基准做温度实验。也可以依照自己实际操作经验来解决问题。
③最后
建议换一下Taq酶，某些进口Taq酶太严谨，导致引物二聚体形成，这也是也许。咱们实验中始终都是使用某国产Taq酶，效果挺抱负。

参 考 文 献
［1］ 李晶，赵晓祥，沙长青等。甲醇酵母基因表达系统研究进展。生物工程进展 1999，19（2）：17-20
［2］ 欧阳立明，张惠展，张嗣同。巴斯德毕赤酵母基因表达系统研究进展。生物化学与生物物理进展，27（2）：151-154
［3］ 彭毅，杨希才，康良仪。影响甲醇酵母外源蛋白表达因素。生物技术通报   ，4：33-36
［4］ 杨晟，黄鹤，章如安。重组人血清蛋自在Pichia pastoris中分泌表达影响因素研究。生物工程学报，16 （6）：675-678
［5］ EasySelect Pichia Expression Kit，Catalog no.K1740-01，Invitrogen
［6］ ［美］Sambrook.J 等著；黄培堂等译。分子克隆实验指南，第三版。北京：科学出版社
［7］ Cleavage to the end of DNA fragments，New Egland Biolabs。（）
［8］ 美国基因动力实验室 基因高效迅速表达试剂盒简介
［9］ 基因工程原理 吴乃虎 北京 科学出版社 第二版 1998
［10］ 姚斌等。高效表达具备生物学活性植酸酶毕赤酵母。中华人民共和国科学(C辑) 28（3）： 237-243
［11］ 涂宣林，宋后燕。P．pastoris高效表达外源蛋白研究进展。(h