基于网络药理学和分子对接探讨五指毛桃汤防治COVID-19的作用机制.pdf

第 7 卷第 3 期2023 年 9 月现 代 牧 业MODERN ANIMAL HUSBANDRYVol.7 No.3Sep.2023收稿日期:2023-04-19基金项目:河南省科技攻关项目(212102311040);河南省国家级大学生创新创业训练计划项目(202210471007);河南省省级大学生创新创业训练计划项目(202210471002)。作者简介:孙彦刚(1989),河南内黄县人,助理研究员,博士。基于网络药理学和分子对接探讨五指毛桃汤防治COVID-19 的作用机制孙彦刚,谢 莎,梁绿圆,孙 浩,陈金雨,曹佳蕾,魏炳琦,王 居,任 冰,吕 越(河南中医药大学,河南 郑州 450046)摘要:运用网络药理学和分子对接的思路和方法,研究五指毛桃汤预防新冠肺炎(Coronavirus disease 2019,COVID-19)的作用机制。从 ETCM、TCMSP、SwissADME、SwissTargetPrediction 等数据库和文献中获取五指毛桃汤各味中药的主要有效成分和作用靶点,导入 Cytoscape 3.8.0 软件绘制药物有效成分-靶点网络图。通过 TTD、GeneCards、OMIM、DrugBank、pharmgkb 等数据库筛选疾病基因,将疾病基因与靶点基因取交集,通过 STRING 平台构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)关系图,筛选得到核心基因。利用 R 语言软件编辑脚本文件进行 GO 功能和 KEGG 通路分析。最后,利用 AutoDock4 及 Pymol 2.2.0 平台进行分子对接分析,预测活性化合物与关键靶点的亲和力。五指毛桃汤 PPI 关系图涉及 7 味中药、155 个活性成分和 749 个靶基因。五指毛桃汤作用于 COVID-19 的核心靶点基因为信号转导和转录激活因子 1(STAT1)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶 Src(SRC)、信号转导和转录激活因子 3(STAT3)、丝裂原活化蛋白激酶 3(MAPK3)、AKT 丝氨酸/苏氨酸激酶 1(AKT1)和丝裂原活化蛋白激酶 1(MAPK1)。GO 功能分析富集到 5023 条生物过程、462 条细胞组成、738 条分子过程;KEGG 通路分析富集到 173条信号通路。分子对接验证显示,活性成分槲皮素、山奈酚、环桑色烯与 SRC、MAPK1、MAPK3、AKT1、STAT1 等靶点基因显示出良好的结合力;环桑色烯与 SARS-CoV-2 3Clike 蛋白具有良好的结合力。五指毛桃汤关键活性成分槲皮素、山奈酚、异鼠李素等可能通过作用 SRC、MAPK1、STAT3、MAPK3、AKT1、STAT1 等核心靶点及 SARS-CoV-2 3Clike 蛋白,调控 T 细胞受体信号通路和 IL-17 信号通路等免疫途径,抑制病毒感染,发挥预防 COVID-19 的作用。关键词:新冠肺炎;五指毛桃汤;网络药理学;分子对接中图分类号:S859.3 文献标识码:A 文章编号:2096-2975(2023)03-0044-12Study on the mechanism of Wuzhimaotao decoction in the prevention and treatment of COVID-19 based on network pharmacology and molecular dockingSUN Yangang,XIE Sha,LIANG Luyuan,SUN Hao,CHEN Jinyv,CAO Jialei,WEI Bingqi,WANG Jv,REN Bing,LV Yve(Henan University of Chinese Medicine,Henan Zhengzhou 450046)Abstract:This study was conducted to reveal the mechanism of Wuzhimaotao decoction in preventing Coronavirus Disease 2019(COVID-19)by network pharmacology and molecular docking.The main effective components and their targets of Wuzhimaotao Decoction were obtained from ETCM,TCMSP,SwissADME,SwissTargetPrediction databases and published papers.Cytoscape 3.8.0 software was used to construct the effective components-targets network diagram.The disease genes were screened on TTD,GeneCards,OMIM,DrugBank,pharmgkb and other databases.The disease genes and target genes were intersected,and the protein-protein interaction(PPI)diagram was constructed by STRING platform to screen the core genes.R language software was used to edit script files for GO function and KEGG pathway analysis.Finally,mo-44孙彦刚,等:基于网络药理学和分子对接探讨五指毛桃汤防治 COVID-19 的作用机制lecular docking analysis was performed using AutoDock4 and Pymol 2.2.0 platforms to predict the affinity of active com-pounds with the key targets.The PPI diagram of Wuzhimaotao Decoction involved 7 Chinese herbs,155 active components and 749 target genes.The core target genes of Wuzhimaotao Decoction which targeting to COVID-19 were signal transduc-tion and transcriptional activator 1(STAT1),proto-oncogene tyrosine protein kinase Src(SRC),signal transduction and transcriptional activator 3(STAT3),mitogen-activated protein kinase 3(MAPK3),AKT serine/threonine kinase 1(AKT1),mitogen-activated protein kinase 1(MAPK1).GO functional analysis enriched 5023 biological processes,462 cell components,738 molecular processes,and KEGG pathway analysis enriched 173 signaling pathways.Molecular doc-king verification showed that the active components quercetin,kaempferol,and cyclomorusin showed excellent binding abil-ity to target genes such as SRC,MAPK1,MAPK3,AKT1,and STAT1.The cyclomorusin also showed good binding ability to the SARS-CoV-2 3Clike protein.Key active ingredients quercetin,kaempferol,isorhamnetin of Wuzhimaotao Decoction may play a role in preventing COVID-19 by acting on SRC,MAPK1,STAT3,MAPK3,AKT1,STAT1 and other core tar-gets,as well as the SARS-CoV-2 3Clike protein,to regulate T cell receptor signaling pathway,IL-17 signaling pathway and inhibit viral infection.Key words:COVID-19;Wuzhimaotao decoction;network pharmacology;molecular docking 由新型冠状病毒 SARS-CoV-2 引起的新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019,COVID-19)疫情至今已流行三年之久。尽管当前主要流行的奥密克戎变异株的致病力下降1、症状减轻,但其传染力强2,能逃避现有药物、抗体和疫苗的保护功效3,4,同时既往感染者重复感染病毒的风险较高5,仍对居民健康造成严重的威胁。中药能改善机体免疫6、抑制炎症损伤7,在COVID-19 的防治中发挥了重大作用。2020 年 2 月9 日,广东省广州市新型冠状病毒肺炎中医药防控专家组公布了“粤抗一号”五指毛桃汤预防方(简称五指毛桃汤):茯苓 15 g、薏苡仁 20 g、五指毛桃20 g、火炭母 15 g、苍术6 g、藿香6 g、甘草6 g。2021年该方被纳入广东省新型冠状病毒肺炎密切接触者中医药干预方案,用于抗疫一线工作人员和密切接触者的疾病预防,在广东全省推广使用。中医认为,新型冠状病毒感染多以湿毒邪气为重,湿毒困阻肺脾导致患者出现昏迷、纳差和高热等症状。五指毛桃汤以“健脾除湿,芳香宣化”为主,五指毛桃为君,行气利湿,健脾补肺,驱除体内湿毒邪气;火炭母、茯苓与薏苡仁共为臣,辅助君药以利湿健脾;苍术、藿香二味宣畅肺气外散表湿,醒脾开胃内祛里湿;甘草为使,坐镇中焦补土以制水。网络药理学采用系统性的网络分析,与中药配方中的整体治疗和协同作用策略相似,在解析中药复方的作用机制方面具有显著优势8,9。分子对接通过评估分子间识别过程中涉及的关键现象来估计配体-受体结合自由能,探索大分子靶标结合位点内采用的配体构象10,能有效验证网络药理学的结果,在中药活性成分筛选和作用机制研究方面应用广泛。本研究采用网络药理学结合分子对接技术的方法,探究五指毛桃汤预防 COVID-19 的主要有效成分和作用靶点,探讨其预防 COVID-19 的作用机制,为临床用药提供参考,也为研发预防 COV-ID-19 的药物提供理论基础。1 资料与方法1.1 五指毛桃汤药物活性成分的筛选与作用靶点的收集采用 TCMSP 数据库(https:/old.tcmsp- OB30%、类药性 DL0.18 作为筛选条件,检索甘草、薏苡仁、茯苓、火炭母、苍术、藿香、五指毛桃的活性成分。在 TCMSP 数据库未搜索到五指毛桃、火炭母。通过检索文献、搜索数据库(ETCM http:/ PubChem(https:/pub-chem.ncbi.nlm.nih.gov/)上找到成分的 SMILES 号,通过SwissADME(http:/www.swissadme.ch/)工具预测潜在的活性成分。纳入高胃肠道 GI 吸收和药物相似性 DL 分析中超过 3 个“是,0 违规”的化合物。通过小分子药物靶点预测在线平台 Swiss Target Pre-diction(http:/swisstargetprediction.ch/)预测化合物的 靶 标,以 Probability 0.0 为 基 筛 选 预 测的靶标。54孙彦刚,等:基于网络药理学和分子对接探讨五指毛桃汤防治 COVID-19 的作用机制1.2 COVID-19 靶点信息的搜集在 OMIM(https:/www.omim.org/)、GeneCards(https:/www.genecards.org/)、DrugBank(https:/ PharmGkb(https:/www.pharmgkb.org/)等数据库中搜索“Novel coronavirus pneumonia”、“Co-rona virus disease 2019”、“SARS-CoV-2”、“COVID-19”11,12,收集汇总并去除重复,获得 COVID-19 靶点信息。1.3 五指毛桃汤药物活性成分-靶点网络图构建利用 R 语言软件对活性成分与靶点关系文件进行处理,得到 Type 文件和 Network 文件,分别导入 Cytoscape 3.8.0 软件进行可视化分析,绘制中药复方药物活性成分-靶点网络图。1.4 五指毛桃汤防治 COVID-19 靶点 PPI 关系图构建运用 STRING 在线平台,选择“Multiple Protreins”,将药物活性成分相关靶点和 COVID-19 疾病靶点的交集基因导入,选择物种“Homo sapiens”。对 PPI关系图进行条件设置,“最低相关分数(Minimum re-quired interaction score)”限定为 0.90013,“网络显示(Network display options)”限定为“隐藏关系网中游离节点(Hide disconnected nodes in the network)”过滤靶点信息。下载 PPI 网络图并导入 Cytoscape 3.8.0 软件,计算 Degree 值。调节节点与连线的属性值,利用 R 语言脚本,根据中位值大小挑选出每项均大于中位值的靶点,经过三次筛选得到核心基因。1.5 GO 功能富集与 KEGG 通路富集分析利用 R 语言软件编辑脚本文件,设置过滤条件“P0.900,并清除游离节点获得 PPI 网络图(图 3),节点数为 298,边数为 453,平均节点度为 9.75,平均局部聚类系数为 0.42。将 PPI 网络文本数据 TSV 文件导入 Cytoscape 3.8.0 软件,对 TSV 文件进行美化调节,获得可视化的 PPI 网络(图 3)。图 3 PPI 网络图84孙彦刚,等:基于网络药理学和分子对接探讨五指毛桃汤防治 COVID-19 的作用机制 通过 CytoNCA 插件分析 PPI 网络的核心靶点。最终得到 6 个核心靶点,分别为信号转导和转录激活因子 1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶 Src(Proto-on-cogene tyrosine-protein kinase Src,SRC)、信号转导和转录激活因子 3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、丝裂原活化蛋白激酶 3(Mi-togen-activated protein kinase3,MAPK3)、AKT 丝氨酸/苏氨酸激酶 1(AKT serine/threonine kinase 1,AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶 1(Mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)。核心靶点网络图见图 4。图 4 核心靶点网格2.5 GO 功能富集与 KEGG 通路富集分析通过富集分析筛选到 3570 条 GO 富集条目。GO 富集分析包括生物过程(Biological process,BP)3176 通路、细胞组成(Cellular component,CC)135 通路、分子功能(Molecular Function,MF)259 通路。选取每组 P 值排名前 10 的条目获得 GO 条形图(图 5)。BP 主要与激酶活性的肽基-酪氨酸修饰、肽基-酪氨酸磷酸化等相关;CC 主要与膜筏、质膜微区、囊泡腔等有关;MF 主要与蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、内肽酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等相关。KEGG 富集结果共得到 173 条信号通路,将 P值排名前 30 的信号通路绘制气泡图(图 6)。通路主要富集在卡波西肉瘤疱疹病毒感染、乙型肝炎、丙型肝炎、甲型流感病毒等病毒感染,及 T 细胞受体信号通路、IL-17 信号通路等免疫途径。2.6 分子对接结果为验证网络药理学分析的结果,选取排名前 10 的活性成分和获得的 6 个关键作用靶点及 SARS-CoV-2 3Clike 蛋白进行分子对接验证,对接信息见表4。图 5 五指毛桃汤 GO 富集分析图 6 五指毛桃汤 KEGG 通路富集分析94孙彦刚,等:基于网络药理学和分子对接探讨五指毛桃汤防治 COVID-19 的作用机制依据分子对接结果,结合能越低,结合能力越强。结合能小于 0 kcal/mol,则表示活性成分和靶点能够自行结合;结合能小于-1.2 kcal/mol,则认为活性成分与靶点具有良好的结合能力。表 4 结果显示,活性成分与靶点的结合能均小于-5 kcal/mol,显示出较强的结合活性。结合稳定的分子对接为槲皮素与 SRC,槲 皮 素 与 MAPK1,山 奈 酚 与AKT1,环桑色烯与 SRC,环桑色烯与 MAPK1、环桑色烯与 MAPK3(图 7)。此外,环桑色烯与 SARS-CoV-2 3Clike 蛋白具有很强的结合能力(图 8)。表 4 关键活性成分与靶点分子对接结合能靶点-PDB-ID中文名英文名结合能/(kcal/mol)SRC-1a1c槲皮素Quercetin-7.28山奈酚Kaempferol-6.93异鼠李素Isorhamnetin-6.34桔皮素Tangeretin-6.13栀子黄素 BGardenin B-6.52金合欢素Acacetin-7.1苜蓿素Tricin-6.57芹菜素Apigenin-6.93香叶木素5,7-Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one-6.74环桑色烯Cyclomorusin-8.04MAPK1-1tvo槲皮素Quercetin-7.49环桑色烯Cyclomorusin-8.12MAPK3-6ges环桑色烯Cyclomorusin-7.68AKT1-6hhf槲皮素Quercetin-6.8山奈酚Kaempferol-7.51异鼠李素Isorhamnetin-5.94桔皮素Tangeretin-6.13栀子黄素 BGardenin B-6.92苜蓿素Tricin-6.7芹菜素Apigenin-6.78STAT1-3wwt槲皮素Quercetin-5.34山奈酚Kaempferol-6.323Clike-6lu7槲皮素Quercetin-5.33山奈酚Kaempferol-5.71异鼠李素Isorhamnetin-5.06桔皮素Tangeretin-6.09栀子黄素 BGardenin B-3.5金合欢素Acacetin-5.67苜蓿素Tricin-5.27芹菜素Apigenin-5.81香叶木素5,7-Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one-6.08环桑色烯Cyclomorusin-6.3605孙彦刚,等:基于网络药理学和分子对接探讨五指毛桃汤防治 COVID-19 的作用机制注:a 槲皮素与 SRC,b 槲皮素与 MAPK1,c 山奈酚与 AKT1,d 环桑色烯与 SRC,e 环桑色烯与 MAPK1、f 环桑色烯与 MAPK3图 7 分子对接结果图 8 环桑色烯与 3Clike 分子对接结果3 讨论3.1 五指毛桃汤配伍分析新型冠状病毒因不断适应宿主而产生变异,迄今为止,已出现阿尔法(Alpha)、贝塔(Beta)、德尔塔(Delta)和奥密克戎(Omicron)等变异毒株15。Omicron 变异株传播速度快、免疫逃逸显著16,已成为当今全球的主要流行毒株,尽管 Omicron 变异株致病力有所下降,但仍存在较大的威胁。千金要方云:“消未起之患,治未病之疾。”中医“治未病”的思想在预防 COVID-19 中具有重要的应用价值,中医防“疫”,源远流长17。COVID-19 属于中医“疫”病范畴,因感受“疫戾”之气,以“湿毒内蕴”为核心病机,“兼夹发病”为临床特征18。中医关注“证候”,通过扶助正气,让机体达到平衡状态,凭借自身的免疫功能驱除外邪。当前 SARS-CoV-2变异毒株仍属于疫病范畴,核心病机仍为“湿、毒、热”18,中医证型多属于风热证,以侵犯上呼吸道为主,病人很少发生肺部病变,所以临床上多出现无15孙彦刚,等:基于网络药理学和分子对接探讨五指毛桃汤防治 COVID-19 的作用机制症状感染者、轻症和普通型的患者19,20。内服预防中药能扶助正气、调理体质、未病先防,降低感染风险。五指毛桃汤中的五指毛桃,美称“广东人参”,健脾补气、祛痰平喘;茯苓、薏苡仁利水渗湿;火炭母清热解毒;苍术燥湿健脾;藿香化湿醒脾。现代研究证实这些药具有抗炎、止咳、增强免疫力等作用21-24,在 COVID-19 的防治中可以通过这些药物调理脾胃、祛湿解毒,从而调动免疫机能以御外邪25。3.2五指毛桃汤作用于 COVID-19 的有效活性成分五指毛桃汤药物活性成分共 155 个,其关键活性成分是槲皮素、山奈酚、异鼠李素等。槲皮素、山奈酚、异鼠李素都属于黄酮类化合物,具有抗菌、抗病毒、镇咳及增强免疫等药理作用26。槲皮素可通过与宿主细胞 ACE2 结合,抑制 SARS-CoV-2 病毒侵入,起到抗病毒作用27。临床研究发现,在 COVID-19 的治疗中使用槲皮素能显著缩短患者住院时间,并有效降低血清中快速 C 反应蛋白(q-CRP)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)的水平28,降低感染水平。山奈酚可通过防止炎症小体形成、抑制氧化应激、诱导细胞自噬、调节细胞凋亡等,有效抑制炎症的发生,发挥抗病毒作用29-31。异鼠李素是槲皮素的直接衍生物,对于肺系炎症具有良好的抗炎作用32。因此,五指毛桃汤可能通过多种有效活性成分,抑制炎症因子形成,减轻炎症反应,起到治疗 COVID-19 的作用。3.3 五指毛桃汤作用于 COVID-19 的核心靶点五指毛桃汤预防 COVID-19 的核心靶点基因,包括 SRC、MAPK1、MAPK3、STAT1、STAT3、AKT1等。SRC 编码酪氨酸蛋白激酶,可通过结合多种病原微生物的效应蛋白,诱发细胞信号转导,进而参与病原微生物的感染33。MAPK1 和 MAPK3 属于MAPK 家族,可通过传递胞内胞外信号,影响宿主防御与凋亡机制,抵御 SARS-CoV-2 病毒的攻击34。MAPK1、MAPK3 是 SARS-CoV-2 感染后细胞因子相关通路调控的关键因素,影响着肺损伤、缺氧、血栓形成 等 相 关 病 理 表 现 的 严 重 程 度35。STAT3、STAT1 属于 STAT 家族,参与调节细胞的生长、存活、分化与凋亡36。STAT1 基因在 COVID-19 患者活化的 CD4+T 细胞、细胞毒性 CD8+T 细胞、初始 T细胞等免疫细胞中表达上调37,而 STAT3 发挥相反作用,在 COVID-19 发病过程中损害抗病毒免疫反应,加重肺纤维化,引起纤维蛋白凝血38。AKT1基因在 SARS-CoV-2 感染中被激活,可通过调节一氧化氮合酶(NOS)活性,并调节肿瘤坏死因子信号通路,减轻 COVID-19 炎症表现39,40。因此,五指毛桃汤可能通过作用于免疫相关节点蛋白,调控机体的免疫反应应答,预防 COVID-19 的发生。3.4 五指毛桃汤 GO 功能富集分析及 KEGG 通路富集分析GO 功能富集分析显示,五指毛桃汤主要通过正调控激酶活性、肽基-酪氨酸磷酸化、肽基-酪氨酸修饰等生物过程预防 COVID-19。KEGG 通路富集结果显示,五指毛桃汤的主要作用靶点参与卡波西肉瘤疱疹病毒感染、乙型肝炎、丙型肝炎、甲型流感病毒等病毒感染,参与 T 细胞受体信号通路、IL-17 信号通路等免疫途径。卡波西肉瘤疱疹病毒miRNA 通过抑制 25-羟基胆固醇,激活炎症反应,抑制 SARS-CoV-2 等多种病毒感染41。慢性乙肝病毒感染引起的免疫障碍可能避免机体对 COVID-19 的过度免疫反应42。感染 SARS-CoV-2 会导致丙型肝炎肝硬化患者数量明显增加43。甲型流感病毒与SARS-CoV-2 相同,感染呼吸道、鼻腔、支气管等人体组织,引发相似感染症状,如发绕、咳嗽、肺炎等44。甲型病 毒 感 染 可 能 诱 导 血 管 紧 张 素 转 换 酶 2(ACE2)明显表达,通过促进病毒进入细胞和提高病毒载量,极大增强 SARS-CoV-2 的感染性,导致感染小鼠的肺损伤更严重,对 SARS-CoV-2 感染起到辅助作用45。CD8+T 细胞对 SARS-CoV-2 的 Spike、N、M 和 ORF3a 多种抗原具有特异性。在 SARS-CoV-2 感染早期就可以检测到 SARS-CoV-2 特异性CD8+T 细胞和 SARS-CoV-2 特异性 CD4+T 细胞46。IL-17 与其受体结合后主要通过激活 JAK-STAT、MAPK、NF-B 等一系列下游信号转导通路发挥作用47。IL-17 信号触发的肺部炎症可能导致更严重的 COVID-19 发作48。因此,五指毛桃汤可能通过25孙彦刚,等:基于网络药理学和分子对接探讨五指毛桃汤防治 COVID-19 的作用机制抗病毒、调节免疫反应等途径,起到预防 COVID-19的作用。3.5五指毛桃汤主要活性成分与核心靶点和SARS-CoV-2 3Clike 蛋白的分子对接分子对接结果表明,五指毛桃汤有效核心成分环桑色烯与 MAPK1(-8.12 kcal/mol)、环桑色烯与SRC(8.04 kcal/mol)、环桑色烯与 MAPK3(-7.68 kcal/mol)、槲皮素与 MAPK1(-7.49 kcal/mol)均具有良好的结合能力,说明五指毛桃汤可能通过作用于免疫相关因子,调节机体的免疫反应。3Clike 是SARS-CoV-2 关键的蛋白酶,参与病毒非结构蛋白基因的切割,在病毒复制增殖过程中发挥着关键的作用49。我们还分析了五指毛桃汤主要有效核心成分与 SARS-CoV-2 3Clike 之间的作用。结果显示,环桑色烯与 SARS-CoV-2 3Clike(-6.36 kcal/mol)具有良好的结合能力,表明五指毛桃汤可能作用于SARS-CoV-2 3Clike 蛋白发挥抗病毒作用。4 结论 五指毛桃汤可能通过槲皮素、山奈酚、异鼠李素桔皮素、栀子黄素 B、金合欢素、苜蓿素、芹菜素、香叶 木 素、环 桑 色 烯 等,作 用 于 SRC、MAPK1、STAT3、MAPK3、AKT1、STAT1 等靶点,影响卡波西肉瘤疱疹病毒感染、乙型肝炎、丙型肝炎、甲型流感病毒等病毒感染及 T 细胞受体信号通路、IL-17 信号通路等免疫途径,同时直接抑制 SARS-CoV-2 增殖,从而发挥预防 COVID-19 的作用。参考文献:1 Pulliam J R C,van Schalkwyk 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