补阳壮通饮对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用及其可能机制研究 (1).pdf
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1、基金项目:国家自然科学基金资助项目(81960801,82160946);广西自然科学基金资助项目(2021GXNSFAA196012);广西一流学科建设开放课题(2019XK148);广西壮族自治区中医药管理局自筹经费科研课题(GXZYZ20210103);广西中医药大学第二批“岐黄工程”高层次人才团队培育项目(2021008)作者单位:530201南宁,广西中医药大学附属国际壮医医院脑病科(王亚南、王凯华、李岩);530200南宁,广西中医药大学(陈真珍);533000 百色,右江民族医学院(黄龙坚)通信作者:王凯华,电子信箱:Wangkaihua1119 补阳壮通饮对脑缺血再灌注损伤大鼠
2、的神经保护作用及其可能机制研究王亚南陈真珍王凯华黄龙坚李岩摘要目的研究补阳壮通饮对脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)大鼠的神经保护作用,并基于 Nrf2 信号通路探讨其作用机制。方法将 SD 大鼠分为空白组、假手术组、模型组、补阳壮通饮组、阿司匹林阳性对照组、补阳壮通饮联合阿司匹林组,每日灌胃给药。采用线栓法构建大脑中动脉闭塞再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)大鼠模型,记录每日神经功能缺损评分,除空白组外,到达第 1、3、7 天时间节点后,检测大鼠体
3、质量变化率、TTC 染色观察脑梗死体积、HE 染色观察脑组织病理学改变情况、免疫荧光和 Western blot 法检测 Nrf2 及 HO-1 蛋白表达的情况。结果与模型组比较,补阳壮通饮组大鼠体质量下降程度减轻(P 0.05),给药 3 天后,ZeaLonga 评分显著降低(P 0.05),神经细胞水肿程度减轻,坏死神经细胞减少,补阳壮通饮可以明显上调 Nrf2、HO-1 蛋白表达(P 0.05),并促进 Nrf2 核移位。结论补阳壮通饮可以减轻 MCAO/R 模型大鼠 CIRI 后的神经损伤,其作用可能是通过 Nrf2/HO-1 介导的抗氧化应激通路实现的。关键词补阳壮通饮MCAO/R
4、Nrf2 通路氧化应激大鼠中图分类号R743.3文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2024.04.009Neuroprotective Effect of Buyang Zhuangtong Yin on Cerebral Ischemia-reperfusion in Rats and Its Possible Mechanism.WANG Yanan,CHEN Zhenzhen,WANG Kaihua,et al.Department of Encephalopathy,Guangxi International Zhuang Medical Hosp
5、ital Affiliated to Guan-gxi University of Chinese Medicine,Guangxi 530000,ChinaAbstractObjectiveTo explore the neuroprotective effect of Buyang Zhuangtong Yin on cerebral ischemia-reperfusion injury(CIRI)in rats,and explore its mechanism based on Nrf2signaling pathway.MethodsThe SD rats were divided
6、 into blank group,shamoperation group,model group,Buyang Zhuangtong Yin group,aspirin positive control group and Buyang Zhuangtong Yin combined withaspirin group,and administered by gavage daily.The rats model of middle cerebral artery occlusion/reperfusion(MCAO/R)was estab-lished by thread occlusio
7、n method.The neurological deficit score was recorded every day.Except the blank group,after reaching the timepoint of 1,3 and 7days,the rate of weight change were measured,the volume of cerebral infarction was observed by TTC staining,thepathological changes of brain tissue were observed by HE stain
8、ing,and the expression of Nrf2 and HO-1 protein was detected by immu-nofluorescence and Western blot.ResultsCompared with the model group,the weight loss of rats in the Buyang Zhuangtong Yin groupwas reduced(P 0.05),and after 3days of administration,the ZeaLonga score was significantly decreased(P 0
9、.05),the degree ofnerve cell edema was reduced,and the necrotic nerve cells was decreased.Buyang Zhuangtong Yin could significantly up-regulated theprotein expression of Nrf2 and HO-1(P 0.05)and promote the nuclear translocation of Nrf2.ConclusionBuyang Zhuangtong Yincan alleviate the nerve injury a
10、fter CIRI in MCAO/R model rats,and its effect may be realized through the anti-oxidative stress pathwaymediated by Nrf2/HO-1.Key wordsBuyang Zhuangtong Yin;MCAO/R;Nrf2 pathway;Oxidative stress;Rats缺血性脑卒中是全球健康的主要问题之一,具有发生率高、致残率高、病死率高、复发率高、经济负担高等特点,对于缺血性脑卒中患者而言,及时恢复梗死区域的血流非常关键,但是恢复血流的同时也会面临再灌注损伤的威胁1。脑
11、缺血再灌注损伤(cere-bral ischemia reperfusion injury,CIRI)是指缺血脑组织在梗死相关血管开通后,可能导致比血管闭塞时更严重甚至不可逆的损伤2。缺血性脑卒中发生后,活04论著J Med Res,April 2024,Vol.53 No.4性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生超过内源性抗氧化剂的储备诱发氧化应激,氧化应激是参与脑缺血再灌注诱导神经元损伤的重要机制,因此缺血性脑卒中发作后积极的抗氧化应激对于减少脑组织的损伤意义重大3,4。核因子红细胞 2 相关因子 2(nu-clear factor erythroid-2 r
12、elated factor2,Nrf2)介导的信号通路被认为是当前最重要的抗氧化应激损伤通路,在抗氧化应激中发挥着重要作用5。中医和壮医作为非常有优势的治疗手段,被广泛应用于脑血管疾病的治疗,笔者所在科室协定方补阳壮通饮在缺血性脑卒中治疗的临床实践中显示出良好的疗效,但其作用机制尚不明确。本研究旨在探索补阳壮通饮不同时点对大脑中动脉闭塞再灌注(mid-dle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型大鼠的神经保护作用,并基于 Nrf2 介导的抗氧化应激信号通路探索其作用机制。材料与方法1.实验动物与分组:SPF 级雄性 SD(Sprague
13、-Dawley)大鼠,6 8 周龄,体质量为 180 220g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。动物饲养于广西中医药大学 SPF 级屏障环境内,室温 22 26,相对湿度为 50%70%,自然昼夜节律,实验动物使用许可证号:SYXK(桂)2019-0001。将 SD 大鼠随机分为空白(Normal)组、假手术(Sham)组、模型(M)组、补阳壮通饮(Z)组、阿司匹林阳性对照(A)组、补阳壮通饮联合阿司匹林(Z+A)组,Normal 组 12 只,余各组每组 36 只。造模当晚起即按照分组进行灌胃给药,Normal 组、Sham 组、M 组予 0.9%氯化钠溶液灌胃,每日 1 次。除 No
14、rmal 组外,其余各组到达造模后 1、3、7 天时间节点时,分别随机选取 12 只大鼠进行相关检测(Normal 组于造模后 7 天进行相关 检测)。本实验经广西中医药大学动物伦理学委员会批准(伦理学审批号:DW20220325-111)。2.药物制备:补阳壮通饮所需中药饮片均由广西国际壮医医院提供。按照剂量配比,加入药材 10 倍量的水,浸泡 30min,煮至沸腾后续煮 1h,滤取药液再次加入药材 8 倍的水,同法续煮 30min,滤取药液与第 1 次混合,于 60 水浴锅中将药液浓缩,分装后-20 保存备用。3.主要试剂与仪器:2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl
15、tetrazolium chloride,TTC)购自北京雷根生物技术有限公司;苏木精-伊红染色液购自南昌雨露实验器材有限公司;RIPA 强效裂解液购自北京索莱宝科技有限公司;Nrf2(bs-2013R)购自北京博奥森生物技术有限公司;HO-1 一抗及羊抗兔 IgG(10701-1-AP,SA00001-2)购自武汉三鹰生物技术有限公司;488 标记山羊抗兔(B100805)购自武汉百仟度生物公司;-actin 一抗(GB15003)购自武汉赛维尔生物科技有限公司;Eclipse Ti-SR 型倒置荧光显微镜、DS-U3 型成像系统购自日本尼康公司;732BR2019 型化学发光成像仪购自美国
16、 Bio-Rad公司。4.MCAO/R 大鼠模型的建立:采用线栓法制备MCAO/R 模型。大鼠麻醉后仰卧位固定于 37 恒温垫上,行 颈 部 正 中 纵 行 切 口,暴 露 左 侧 颈 总 动 脉(common carotid artery,CCA)、颈内动脉(internal ca-rotid artery,ICA)、颈外动脉(external carotid artery,ECA),结扎 ECA,游离 CCA 至分叉并在下方打结,在距 CCA 分叉处 1.5cm 左右的地方扎一个小口,边松动脉夹边将线栓插入,栓塞大脑中动脉,2h 后将线栓拔出,形成大脑的缺血再灌注,Sham 组行相同操作但
17、不插栓6。5.体质量变化率的测定:造模前及造模结束后的每一天记录大鼠的体质量,计算其体质量变化率。体质量变化率(%)=(当日体质量-造模前体质量)/造模前体质量 100%。6.动物模型神经功能缺损评分:参照 MCAO/R模型 ZeaLonga 评分法,评分分为 5 个等级:0 分:无神经损伤症状;1 分:不能完全伸展对侧前爪;2 分:向对侧转圈;3 分:向对侧倾斜及不能站立;4 分:不能自发行走,意识丧失6。评分越高,神经功能缺损程度越严重。7.脑梗死体积百分比测定:采用 TTC 染色法对大鼠脑梗死体积进行测定:各组各时间点选取 6 只大鼠行腹腔麻醉,心脏灌注后迅速断头取脑,-20 冷冻 20
18、min 后切片,共切 6 片,每片约 1.5mm,将切片置于 TTC 染液中,避光恒温 37 敷育 30min,染色后用4%多聚甲醛固定拍照,用 Image-Pro Plus 6.0 软件进行图片分析,计算脑组织梗死体积占全脑体积的百分比。8.苏木精-伊红(HE)染色观察脑组织病理学改变:4%多聚甲醛固定后梯度脱水,石蜡包埋,切片,烤片,HE 染色后树胶封固,观察脑组织病理学改变。9.免疫荧光染色:4%多聚甲醛固定后用 0.2%TritonX-100 处理 30min,TBST 洗涤后室温封闭 1h;分别加入 Nrf2、HO-1 一抗,4 条件下孵育过夜后14医学研究杂志 2024 年 4 月
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