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m6A修饰相关的长链非编码RNA对肾透明细胞癌预后和免疫治疗的研究 (1).pdf
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1、基金项目:河南省重点研发与推广专项(科技攻关)(222102310651);河南省卫健委国家中医临床研究基地科研专项(2022JDZX142)作者单位:450002郑州,河南省中医院泌尿外科(白洋洋、陈瑞廷、孙继建);450014郑州大学第二附属医院妇产科(郭依琳)通信作者:白洋洋,电子信箱:yangyangbai2010 m6A 修饰相关的长链非编码 RNA对肾透明细胞癌预后和免疫治疗的研究白洋洋郭依琳陈瑞廷孙继建摘要目的探究与 N6-甲基腺嘌呤(m6A)相关的长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)对肾透明细胞癌(renal clear cell carc
2、inoma,ccRCC)预后和免疫治疗的特征。方法通过 TCGA 数据库下载 532 例 ccRCC 患者组织和 72 例正常肾组织的转录组数据和临床特征数据,利用共表达和单因素 COX 回归分析筛选与预后和 m6A 相关的 lncRNA。基于预后和 m6A相关的 lncRNA 的表达进行聚类分析,分析两种聚类分型与免疫检查点程序性死亡配体 1(programmed death-ligand 1,PD-L1)和细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)表达的相关性。构建 LASSO COX回归风险预
3、后模型,验证其临床应用价值,利用 ESTIMATE 方法比较 ccRCC 肿瘤微环境的差异,免疫表观评分(immunophe-noscore,IPS)预测 ccRCC 对免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor,ICI)的敏感度。结果通过共表达和单因素 COX 回归分析筛选 出 29 个与 预后 和 m6A 相关 的 lncRNA,大多 数 在 ccRCC 组 织 中 表 达 上 调,而 COL18A1-AS1、AC007066.2 和AC018752.1 则表达下调。通过聚类分析将 532 例 ccRCC 组织样本分为 cluster1 组和 cluster2
4、 组,cluster2 组预后更差,PD-L1 和CTLA4 表达更高。利用 LASSO COX 回归算法确定 8 个与预后和 m6A 相关的 lncRNA,建立 ccRCC 风险预后模型,该模型在不同临床特征中均有较好的预测价值。依据模型计算风险值将患者分为高风险组和低风险组。高风险组患者预后更差,富含更多免疫细胞成分,对 ICI 治疗更敏感。结论m6A 相关的 lncRNA 对 ccRCC 患者的预后预测和免疫治疗指导具有重要意义。关键词M6ALncRNA肾透明细胞癌预后免疫治疗中图分类号R737.11文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2024.04.
5、021Analysis of m6A Modification-related Long Non-coding RNA on Prognosis and Immunotherapy of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.BAIYangyang,GUO Yilin,CHEN Ruiting,et al.Department of Urology,Henan Province Hospital of TCM,The Second Affiliated Hospital ofHenan University of Chinese Medicine,Henan 4500
6、02,ChinaAbstractObjectiveTo investigate the prognostic and immunotherapy characteristics of N6-methyladenine(m6A)-related longnon-coding RNA(lncRNA)in renal clear cell carcinoma(ccRCC).MethodsTranscriptome data and clinical characteristic data of532 ccRCC tissues and 72 normal kidney tissues were do
7、wnloaded from the TCGA database,and lncRNAs related to prognosis and m6Awere screened by co-expression and univariate COX regression analysis.Cluster analysis was performed based on the prognosis and theexpression of m6A-related lncRNA,the correlation between the two clusters and the expression of i
8、mmune checkpoints programmeddeath-ligand 1(PD-L1)and cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4(CTLA-4)was analyzed.The LASSO COX regressionrisk prognosis model was constructed to verify its clinical application value,and the ESTIMATE method was used to compare the differ-ences in the tumor microen
9、vironment of ccRCC,and the immunophenoscore(IPS)predicted the sensitivity of ccRCC to immune check-point inhibitor(ICI).ResultsTwenty-nine lncRNAs associated with prognosis and m6A were screened by co-expression and univari-ate COX regression analysis,most of which were up-regulated in ccRCC tissues
10、,while COL18A1-AS1,AC007066.2 and AC018752.1 were down-regulated.The 532 ccRCC tissue samples were divided into cluster1group and cluster2group by cluster analysis.The clus-ter2group had worse prognosis and higher expression of PD-L1 and CTLA4.Eight lncRNAs related to prognosis and m6A were identifi
11、edby LASSO COX regression algorithm to establish a ccRCC risk prognostic model,which has good predictive value in different clinical fea-tures.Patients were divided into high-risk group and low-risk group based on risk scores calculated by the risk prognostic model.Pa-tients in the high-risk group h
12、ad a worse prognosis,more immune cell components,and were more sensitive to ICI treatment.Conclu-sionm6A-related lncRNA is of great significance for the prognosis prediction and immunotherapy guidance in ccRCC patients.Key wordsM6A;LncRNA;Clear cell renal cell carcinoma;Prognosis;Immunotherapy701医学研
13、究杂志 2024 年 4 月第 53 卷第 4 期论著肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是肾癌最常见的病理类型,可占到 80%86%1。尽管手术切除是治疗早期 ccRCC 的有效方法,但是针对晚期及合并复发或转移患者的治疗方式仍有限,导致这类患者的预后较差2。因此,探索与ccRCC 发病密切相关的分子机制有望为新肿瘤基因靶向治疗提供策略和理论支持。N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladeno.sine,m6A)修饰是真核生物 RNA 最常见的一种表观修饰方式,是位于腺嘌呤第 6 位氮原子上的甲基化修饰,存在于各种不同类型的 RNA 上,
14、包括 mRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、微小 RNA(micro RNA,miRNA)、环状 RNA(circular RNA,circRNA)等3。m6A RNA 甲基化修饰由甲基转移酶、去甲基化酶和甲基化识别蛋白组成,共同参与 ccRCC 的发生、发展4,5。lncRNA 是一种长度超过 200nt 的非编码 RNA分子,可以在表观遗传调控、转录调控和转录后调控等多方面参与人体内多种重要的调控过程6。近年来,lncRNA 被发现异常表达与肿瘤的增殖、转移、凋亡和耐药性相关7。然而 m6A 修饰相关的 lncRNA是否可能参与 ccRCC 的进展仍有待于阐明。本研究通过 TCGA(
15、The Cancer Genome Atlas)数据库下载ccRCC 的转录组数据,利用生物信息学的方法筛选与m6A 相关的 lncRNA,建立风险预后模型,分析预后模型的诊断和预 测价值,探 索 其 对 免 疫 治 疗 的 指 导意义。材料与方法1.数据下载和处理:从 TCGA 数据库下载 541例 ccRCC 患者组织和 72 例正常肾组织的转录组数据和临床特征数据。剔除重复和不完整的数据后,本研究共纳入 532 例 ccRCC 患者组织样本和 72 例正常肾组织样本。通过人类参考基因组及注释文件,区分转录组数据中的 mRNA 和 lncRNA。2.m6A 相关 lncRNA 的筛选:查阅
16、相关文献,选择 26 个 m6A 调 节 因 子(METTL3、METTL5、MET-TL14、METTL16、WTAP、VIRMA、ZC3H13、RBM15、RBM15B、YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、HNRNPC、FMR1、LRPPRC、HNRNPA2B1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ELAVL1、RBMX、FTO、ALKBH5、ALKBH3)。在 R 软件中,利用 limma 包进行 m6A 和 lncRNA 共表达分析,鉴定出 190 个与 m6A相关的 lncRNA,筛选条件为相关系数 0.7 或相关系数 -0.7,P 0.
17、7 或 -0.7,P 0.001 的 lncRNA。利用单因素COX 回归分析,进一步筛选出 29 个与预后和 m6A 相关的 lncRNA,详见图 1A。29 个与预后和 m6A 相关的 lncRNA 在 ccRCC 组织和正常肾组织中的表达均存在差异(图 1C)。绘制 29 个与预后和 m6A 相关的lncRNA 在 ccRCC 组织和正常肾组织中的热图,发现除 COL18A1-AS1、AC007066.2 和 AC018752.1 以外,lncRNA 在 ccRCC 组织中表达高于正常肾组织(图 1B)。2.m6A 相关 lncRNA 聚类分析结果:对 29 个与801论著J Med R
18、es,April 2024,Vol.53 No.4图 1肾透明细胞癌中筛选与预后和 m6A 相关的 lncRNAA.单变量 COX 回归分析;B.m6A 相关 lncRNA 表达的箱线图;C.m6A 相关 lncRNA 表达的热图。P 0.001预后和 m6A 相关的 lncRNA 进行样本聚类分析。选择 k=2 对样本分型,将样本分为 cluster1 组和 clus-ter2 组。绘制两种聚类分型表达热图,发现 cluster1组在 29 个 m6A 相关 lncRNA 中的表达低于 cluster2组(图 2A)。绘制两种聚类分型的 Kaplan-Meier 曲线,发 现 cluster
19、2 组 的 生 存 率 低 于 cluster1 组(图2B)。最后,分析 cluster1 组和 cluster2 组免疫检查点PD-L1 和 CTLA4 的表达情况,结果发现 cluster2 组中 PD-L1 和 CTLA4 表达更高(图 2 中 C 和 D),提示两种 cluster 分型之间可能存在肿瘤免疫微环境的差异。3.风险预后模型的建立:利用 LASSO COX 回归算法确定 8 个与预后和 m6A 相关的 lncRNA 建立ccRCC 风 险 预 后 模 型。风 险 评 分=1.5531 AL133243.3 表达量+0.1702 AL162586.1 表达量-0.0258
20、SH3BP5-AS1-0.1494 AL136295.7 表达量-2.0571 COL18A1-AS1 表达量-0.3995 AC018752.1 表达量+0.6396 AL008718.3 表达量+0.1063 AC084018.1 表达量。将 532 例 ccRCC 患者利用 Create Data Partition 函数分为测试集(n=268)和验证集(n=264)。在测试集中,计算每例ccRCC 患者的风险评分,根据风险评分的中位值,将患者分为高风险组和低风险组。绘制高低风险组患者的 Kaplan-Meier 曲线,发现高风险组的患者预后更差(P 0.001,图 3A),5 年总生存
21、率的 AUC 为0.773(图 3B)。在验证集中,高风险组的患者预后也更差(P 0.001,图 3C),5 年总生存率的 AUC 为0.688(图 3D)。4.风险预后模型的验证和临床特征分析:为了进一步评估建立的风险预后模型的应用价值,笔者首先901医学研究杂志 2024 年 4 月第 53 卷第 4 期论著图 2肾透明细胞癌中两种 m6A 相关 lncRNA 聚类分型A.cluster1 和 cluster2 的表达热图;B.cluster1 和 cluster2 的生存曲线;C.PD-L1 在 cluster1 和 cluster2 中的表达;D.CTLA-4 在 cluster1 和
22、 cluster2 中的表达图 3肾透明细胞癌风险预后模型建立A.训练集中高危组和低危组的生存曲线;B.训练集中的 5 年总生存 ROC 曲线;C.验证集中高危组和低危组的生存曲线;D.验证集中的 5 年总生存期 ROC 曲线011论著J Med Res,April 2024,Vol.53 No.4分别在测试集和验证集中,对 ccRCC 患者的临床病理特征和风险评分进行单因素和多因素分析,单因素COX 分析结果发现,年龄、组织分级、临床分期、T、M和风险评分是 ccRCC 患者预后的独立因素(图 4A),多因素 COX 分析结果发现年龄、组织分级、临床分期和风险评分是 ccRCC 患者预后的独
23、立因素(图 4B)。这些结果表明笔者建立的风险预后模型可以用于评估 ccRCC 的预后评价指标。图 4风险预后模型的临床应用价值A.风险评分的单因素分析;B.风险评分的多因素分析;C.风险评分和临床特征的热图。P 50 岁和50 岁)、性别、组织分级(G1 G2和 G3 G4)、临床分期(期和 期)、T(T1 2和 T3 4)和 M(M0和 M1)亚组中,高风险的患者生存率均低于低风险患者,预后更差,提示该风险预后模型在不同的临床特征中均有较好的预测价值。5.风险预后模型的免疫浸润和免疫治疗分析:利用 ESTIMATE 方法评估高风险组和低风险组每个样本中 Immune 分数、Stromal
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