HTRA3基因对脉络膜新生血管和M2型巨噬细胞极化的影响.pdf
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1、欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉引文格式:肇莉莉,王萍,孙连义,马为梅,张乐,喻磊 基因对脉络膜新生血管和 型巨噬细胞极化的影响 眼科新进展,():【实验研究】基因对脉络膜新生血管和 型巨噬细胞极化的影响肇莉莉王萍孙连义马为梅张乐喻磊欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉作者 简 介:肇 莉 莉(:),女,年 月出生,辽宁人,硕士研究生,副主任医师。研
2、究方向:眼科学。:通信作者:喻磊(:),男,年 月出生,陕西人,硕士研究生,主任医师,儿童眼病中心主任。研究方向:眼科学。:收稿日期:修回日期:本文编辑:盛丽娜基金项目:陕西省自然科学基础研究计划项目(编号:);陕西省卫生健康科研基金项目(编号:)作者单位:陕西省西安市,西安市人民医院(西安市第四医院),陕西省眼科医院,西北大学附属人民医院眼科(肇莉莉,王萍,孙连义,马为梅,喻磊);陕西省西安市,西北妇女儿童医院眼科(张乐)【摘要】目的探讨 丝氨酸肽酶()基因对脉络膜新生血管()和 型巨噬细胞极化的影响。方法收集 例湿性年龄相关性黄斑变性()患者(组)和 例同期健康体检者(健康组)的空腹静脉血
3、,通过 检测血清 水平。将 细胞随机分为对照组、组和 组,使用 将 和 慢病毒载体分别转染到 组和 组 细胞中,通过 和 检测 的转染情况。将 细胞随机分为 组、组、组和 组,细胞转染后,组 细胞在完全 培养基中进行常氧培养,其他组细胞在添加 氯化钴()的 培养基中进行低氧培养,使用 测定小管形成。将 小鼠随机分为对照组、组、组和 组,每组 只。对照组为未建模的小鼠,其他组为激光诱导的 模型小鼠。向 组和 组小鼠玻璃体内分别注射 滴度为 的 和 慢病毒载体。对照组和 组小鼠注射 。注射后,对小鼠进行荧光素眼底血管造影()检测和眼球苏木精伊红()染色。通过 检测 细胞或各组小鼠脉络膜组织中 、类
4、几丁质酶 样蛋白()、精氨酸酶 ()、诱导型一氧化氮合酶()、环氧化酶 ()和血管内皮生长因子()水平。通过 检测 细胞或脉络膜组织中 、和细胞核核因子 ()的蛋白表达水平。结果与健康组比较,组患者的血清 水平升高(,)。与对照组和 组比较,组 细胞的 和蛋白表达水平降低()。与 组比较,组 细胞的闭合管腔数量、和 的 和蛋白表达水平均增加(均为 )。与 组比较,组 细胞的闭合管腔数量、和 的 和蛋白表达水平均减少(均为 )。与对照组比较,组小鼠的 的 和蛋白表达水平增加,相对荧光强度升高,和 水平升高,和 水平降低,细胞核 蛋白表达水平升高(均为 )。与 组比较,组小鼠的 的 和蛋白表达水平
5、减少,相对荧光强度降低,和 水平降低,和 水平升高,细胞核 蛋白表达水平降低(均为 )。结论下调 可抑制 形成和 型巨噬细胞极化,可能是防治 的重要潜在靶点。【关键词】湿性年龄相关性黄斑变性;脉络膜新生血管;丝氨酸肽酶 ;型巨噬细胞极化【中图分类号】湿性年龄相关性黄斑变性()是一种累及视网膜黄斑区的眼病之一,在老年人群中具有较高的发病率 。脉络膜新生血管()是 的典型病变,也是导致患者视力丧失的主要原因 。目前,虽然玻璃体内注射血管内皮生长因子()抑制剂在治疗 方面取得了一定疗效 ,然而,抗 药物存在耐药性问题 ,并且会引起眼压升高 、眼部感染 等并发症,因此,仍需要开发 的新型治疗手段。免疫
6、微环境失衡是导致 的始发因素,病变部位出现大量巨噬细胞浸润,这些巨噬细胞通过分泌 和炎性因子促进血管内皮细胞增殖并引起新生血管渗漏,导致 形成 。巨噬细胞具有可塑性,可极化为 和 型,其中 型极化可导致脉络膜血管形成 。因此,调控巨噬细胞表型是治疗 的有效途径。丝氨酸肽酶 ()是 年首次报道的一个蛋白质编码基因,位于染色体 上 。与 类似,都能抑制转化生长因子 家族蛋白介导的信号通路 。据报道,基因启动子里的一个单核苷酸多态性与 有关联,含有 多态性的人群发生 的危险度比正常人高 倍 。在 小鼠视网膜中表达升高,提示 很可能参与 病变的进展 。另外,可能调节免疫细胞功能 。本研究旨在揭示 基因
7、对 和 型巨噬细胞极化的影响,从而开发 的新型治疗靶标。材料与方法 材料 实验试剂慢病毒载体由吉玛基因合成。培养眼 科新进展 年 月第 卷第 期 :基(货号:)购自美国 公司。氯化钴()(货号:)购自美国 公司。(货号:)购自美国 公司。(货号:)购自美国 公司。苏木精伊红()染色试剂盒(货号:)、(货号:)、裂解液(货号:)、试剂盒(货号:)购自碧云天生物技术研究所。荧光素钠(货号:)购自美国 公司。试剂盒(货号:)购自日本 公司。(货号:)购自美国 公司。(货号:)、(货号:)、核因子 ()(货号:)、(货号:)和 (货号:)一抗以及 标记的 二抗(货号:)购自英国 公司。实验细胞和动物恒
8、河猴脉络膜血管内皮细胞系()购自美国 。只 级雄性老龄 小鼠(个月龄,体重 )由西北大学提供 (陕)。小鼠在 、相对湿度、循环照明环境中使用标准小鼠饲料和纯净水饲养。方法 血清样本收集 年 月至 年 月期间,收集西安市人民医院(西安市第四医院)就诊的 例 患者为 组,其中男 例,女 例,年龄 ()岁,参考 国际诊断标准 对患者进行诊断。剔除伴有其他视网膜疾病、恶性肿瘤、心脑血管系统疾病、器官病变及接受治疗的 患者。收集同期来院体检的健康者 例为健康组,其中男 例,女 例,年龄 ()岁。健康组与 组受试者的年龄、性别比例相比,差异均无统计学意义(均为 )。收集两组受试者的空腹静脉血,检测血清 水
9、平。本研究通过西安市人民医院(西安 市 第 四 医 院)伦 理 委 员 会 审 批(审 批 号:),受试者均知情同意。细胞培养与转染处理将 细胞培养在添加体积分数 胎牛血清和 双抗的 培养基中,置于 和含体积分数 的细胞培养箱中培养。细胞生长至对数期后用于实验。将 细胞随机分为对照组、组和 组,孔板中接种 细胞并培养至 融合,按照试剂盒说明,使用 将 和 慢病毒载体分别转染到 组和 组 细胞。对照组细胞不进行转染。转染 后,通过 和 检测 的转染效率。每组设置 个复孔。细胞分组及处理验证 转染效率后,将 细胞随机分为 组、组、组和 组。其中,组和 组细胞分别转染 和 ;组 细胞在完全 培养基中
10、进行常氧培养,其他组细胞在添加 的 培养基中进行低氧培养。每组设置个复孔。小管形成测定使用 (每孔 )包被 孔板,室温静置 ,加入 分组处理后的细胞 (每孔 个 细胞),培养 后在显微镜下观察小管形成情况,软件计算闭合管腔数量。每组设置 个复孔。激光诱导 小鼠模型使用复方托吡酰胺滴眼液对小鼠进行散瞳,苯巴比妥钠经腹腔注射麻醉小鼠()。围绕视盘用氩激光(激光波长 ,输出功率 ,曝光时间 ,光斑直径 )对小鼠双眼发射四个激光点。光凝后有白色气泡产生证实 膜破裂,表明建模成功。动物分组及处理将小鼠随机分为对照组、组、组和 组,每组 只。对照组为未建模的小鼠,其他组为 建模成功的小鼠。使用盐酸奥布卡因
11、进行表面麻醉,然后使用 穿刺针头向 组和 组小鼠玻璃体内分别注射 滴度为 的 和 慢病毒载体,对照组和 组小鼠玻璃体内注射 ,均为双眼注射。注射后给予左氧氟沙星滴眼液抗感染。荧光素眼底血管造影注射后 ,所有小鼠均行荧光素眼底血管造影()检查。使用复方托吡酰胺滴眼液对各组小鼠进行散瞳,苯巴比妥钠经腹腔注射麻醉小鼠()。然后经腹腔注射 荧光素钠,后拍摄眼底照片,在 激发光和 发射光下使用滤光片获取图像。使用 软件计算 的平均荧光强度。样本收集所有小鼠 检查结束后处死,摘取双眼眼球,取双眼中任意一只眼球行 多聚甲醛固定,用于 染色;另一只眼球在显微镜下冰上小心去除结缔组织和肌肉,去除眼前节,分离出脉
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