LINC02535_miR-30b_CCNA2轴通过抑制细胞凋亡和促进增殖参与肺腺癌的发生和发展.pdf
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1、 基金项目:国家自然科学基金青年基金(82000012);徐州医科大学附属医院发展基金资助项目(XYFY2020006);江苏省重点实验室开放研究课题(XZSYSKF 2020021);无锡市卫生健康委中青年拔尖人才资助计划(BJ2023101);江阴市中青年卫生优秀人才资助计划(JYOYT202301)通信作者,E-mail:wanglanzm LINC02535/miR-30b/CCNA2 轴通过抑制细胞凋亡和促进增殖参与肺腺癌的发生和发展顾一航,缪健,王琳,殷泉忠,王兰(徐州医科大学江阴临床学院老年医学科,江苏 江阴 214400)摘要:目目的的 旨在探究 LINC02535/miR-3
2、0b/CCNA2 轴在肺腺癌(lungadenocarcinoma,LUAD)发生和发展中的作用机制,通过分析基因表达情况发现相关分子标志物和信号通路,并验证其作用。方方法法 从癌症基因组图谱(TCGA)中获取 LUAD 的 lncRNA、miRNA 和 mRNA 的表达谱数据和临床数据,利用 R3.6.0 软件的“edgeR”差异分析数据包筛选差异表达基因,进一步利用 R3.6.0 软件的“WGCNA”数据包进行加权基因共表达网络分析,得到构成 ceRNA 的基因共表达网络图。同时,对 2 种人 LUAD 细胞系 A549、H1299 和 1 种标准支气管上皮细胞系BEAS-2B 进行细胞培
3、养和转染,使用 qRT-PCR、CCK-8、EdU 分析和细胞周期分析等方法评估细胞增殖。结结果果 从 TCGA 数据库中获取了高表达的 lncRNA、低表达的 miRNA 和高表达的 mRNA,通过加权基因共表达网络分析筛选出 20 个生存分析预后显著差异的 lncRNA。其中,LINC02535 与 miR-30b 呈负相关,并且存在结合靶点。进一步研究发现,LINC02535 在 LUAD 组织和细胞系中显著过表达,而 miR-30b 则显著低表达。通过降低LINC02535 的表达水平,发现其对细胞增殖有抑制作用。此外,降低 LINC02535 的表达水平还发现其对细胞凋亡和 G1 向
4、 S 期转变有抑制作用。同时,LINC02535 下调导致 miR-30b 的表达升高,使得 CCNA2 的表达下降。结结论论 LINC02535/miR-30b/CCNA2 轴通过抑制细胞凋亡和促进增殖参与了 LUAD 的发生和发展,可能成为潜在治疗LUAD 的分子靶点。关键词:肺腺癌;lncRNA;LINC02535;ceRNA;增殖;细胞周期中图分类号:R734.1 文献标志码:A 文章编号:2096-3882(2024)02-0087-08DOI:10.3969/j.issn.2096-3882.2024.02.002LINC02535/miR-30b/CCNA2 axis parti
5、cipates in the pathogensis of lung adenocarcinoma by inhibiting apoptosis and promoting proliferation GU Yihang,MIAO Jian,WANG Lin,YIN Quanzhong,WANG Lan(Department of Geriatrics,Jiangyin Clinical College,Xuzhou Medical University,Jiangyin,Jiangsu 214400,China)Abstract:ObjectiveTo explore the role o
6、f the LINC02535/miR-30b/CCNA2 axis in the pathogenesis of lung adenocarcinoma(LUAD),and identify relevant molecular markers and signaling pathways by analyzing gene expression and verify their effects.MethodsThe gene expression profiles of lncRNA,miRNA,and mRNA in LUAD and related clinical data were
7、 obtained from the Cancer Genome Atlas(TCGA),and differentially expressed genes were screened using the edgeR differential analysis package in R3.6.0 software.Furthermore,weighted gene co-expression network analysis was performed using the WGCNA package in R3.6.0 software to establish a gene co-expr
8、ession network map of ceRNA.Meanwhile,two human LUAD cell lines A549 and H1299 and one standard bronchial epithelial cell line(BEAS-2B)were cultivated for transfection.Cell proliferation was evaluated by qRT-PCR,CCK-8 assay,EdU assay,and cell cycle analysis.ResultsFrom the TCGA database,high-express
9、ion lncRNAs,low-expression miRNAs,and high-expression mRNAs were obtained.Through weighted gene co-expression network analysis,20 lncRNAs with significant differences in survival analysis were screened out.Among them,LINC02535 showed a significant negative correlation with miR-30b,with binding targe
10、ts.Further research found that LINC02535 was overexpressed in LUAD 78徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(2)tissues and cell lines,while miR-30b was significantly down-regulated.Reduced expression of LINC02535 resulted in inhibitory effect on cell proliferation,cell apoptosis and G1 to S phase transit
11、ion.Meanwhile,down-regulation of LINC02535 led to increased expression of miR-30b,and then decreased the expression of CCNA2.ConclusionsThe LINC02535/miR-30b/CCNA2 axis participates in the pathogenesis of LUAD by inhibiting apoptosis and promoting proliferation,which may become a potential molecular
12、 target for treating LUAD.Key words:lung adenocarcinoma;lncRNA;LINC02535;ceRNA;proliferation;cell cycle 肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是一种常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率在全球范围内均居高不下1。尽管近年来肺癌的诊断和治疗技术取得了显著进展,但 LUAD 的预后仍然较差,主要原因是早期诊断困难,且容易发生转移。因此,寻找新的生物标志物和治疗方法对于提高 LUAD 患者的生存率具有重要意义。长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)
13、是一类长度超过 200 个核苷酸的非编码 RNA 分子,它们在基因表达调控、细胞周期调控、凋亡抑制等方面发挥着重要作用2。近年来,越来越多的研究表明,lncRNA 在肺腺癌的发生、发展和转移过程中具有重要的调控作用3。例如,一 些 lncRNA 可 以 作 为 竞 争 性 内 源 RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)与 miRNA 结合,从而解除 miRNA 对靶基因的抑制作用,促进肿瘤细胞的生长和转移4;另一些 lncRNA 则可以直接结合到蛋白质上,影响其功能,进而影响肿瘤细胞的生物学行为5。此外,lncRNA 还可以通过调控表观遗传修饰、参与信号通路
14、等方式影响肺腺癌的发生和发展6。因此,深入研究 lncRNA 在 LUAD 中的作用机制,有望为 LUAD 的诊断和治疗提供新的靶点和策略。本研究中,通过生物信息学分析获得 lncRNA LINC02535,并通过细胞实验验证 LINC02535 对LUAD 的增殖和细胞周期的影响,为 LUAD 的治疗提供理论和实验依据。1 资料和方法1.1 临床资料 选取 2021 年 1 月2022 年 12 月江阴市人民医院老年医学科及胸外科收治的 9 例LUAD 患者病理活检或手术中切除的 LUAD 组织及相应癌旁组织(癌灶 5 cm 处)标本。纳入标准:经组织病理学诊断后确诊为 LUAD 的患者;患
15、者在手术前未经放疗、化疗,未服用过靶向药物;临床资料完整。排除标准:合并其他恶性肿瘤者;合并严重心、肝、肾等重要脏器功能障碍者;妊娠期或哺乳期女性。收集患者所有临床资料,患者均自愿提供 LUAD 组织及癌旁组织标本。本实验已获江阴市人民医院医学伦理委员会批准(批件号:2021012)。1.2 研究材料1.2.1试验细胞LUAD 细胞系 A549、H1229 和正常肺上皮细胞系 BEAS-2B 购自南京普皓生物技术有限公司。1.2.2 主要试剂与材料 siRNA 干扰套餐(中国通用生物);BeyoClickTM EdU-555 细胞增殖检测试剂盒(中国碧云天生物 C0075L);Annexin
16、V-FITC/PIA poptosis Detection Kit(中国 PerhorPH20015);Cell Cycle Detection Kit(中国 PerhorPH20018)。1.3 研究方法1.3.1 生物信息学分析 从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中 获 取 LUAD 的lncRNA、miRNA 和 mRNA 的表达谱数据和临床数据。利用 R3.6.0 软件的“edgeR”差异分析数据包筛选差异表达基因,以 Log2FC(T/N)2 或-2 及P 0.05 作为筛选条件,获取具有差异表达的lncRNA、miRNA 和 mRNA。进一
17、步利用 R3.6.0 软件的“WGCNA”数据包进行加权基因共表达网络分析,分别得到高表达 lncRNA-低表达 miRNA 配对和低表达 miRNA-高表达 mRNA 配对,综合 2 组配对数据得到 ceRNA 网络,利用软件 cytoscape 进行可视化操作,得到构成 ceRNA 的基因共表达网络图。从获得的基因共表达网络图中,设定筛选课题所需的主要研究目标 lncRNA 的条件:目标 lncRNA 的生存分析预后有显著差异;在 starbase 能预测到与之共表达的 miRNAs 的相互结合靶点;与相互结合的miRNAs 呈负相关。1.3.2细胞培养和转染2 种人 LUAD 细胞系A5
18、49、H1299 和 1 种标准支气管上皮细胞系 BEAS-2B 从普好生物技术有限公司(中国南京)获得,并在补充有 10%胎牛血清(FBS 澳大利亚 AusGene X)。所有细胞系均在 37 含 5%CO2的潮湿空气中培养。针对 LINC02535 和阴性对照的3 种小干扰RNA(siRNA)由 Gene Pharma(中国上海)生产。当88徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(2)细胞密度达到约 70%80%时,用 Lipofectamine2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)转染 siRNAs。这些siRNAs 的序列如下:s
19、iRNA-1-90-112(siRNA1),5-CACAACUUUUCAUCUGAAATT-3,siRNA-2-164-186(siRNA2),5-GUAAGAACGGAAAGGAAAUTT-3,siRNA-3230-252(siRNA3),5-GUUUACUGGGCAACUUCUUTT-3,siNC,5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3。1.3.3定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)TRIzol(Invitrogen,美国)用于从培养的细胞系中提取总 RNA。使用 PrimerScriptRT 试剂盒(ThermoFisherK1622,美国)将总 RNA 转录成 cDNA。
20、实时PCRMasterMix(SYBRGreen)试剂盒(东洋纺,日本)用于实时 PCR,所有反应重复 3 次。qRT-PCR 中使用的引物由金斯瑞生物技术有限公司(中国南京)设计和生产,引物序列如下:LINC02535,F:5-AGCCCAGGAATTCGAGACAA-3,R:5-CCTCAGCCTCCCACACTAAA-3;GAPDH,F:5-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3,R:5-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3。以 GAPDH 作为内参对照,定量结果采用 2-Ct表示。所有操作均根据制造商的说明进行。1.3.4 细胞计数分析 细胞计数试剂盒-8(C
21、CK-8)分析评估细胞增殖。首先,将 3103个转染细胞接种到 96 孔板的每个孔中。在温育 2、4、6、8 或 10 d 后,将含有 10 l CCK-8 溶液(Vazyme,中国)的100 l 培养基加入每个孔中,并温育 3 h。自动酶标仪(MDC Max Plus,美国)用于检测 450 nm 处的光密度。1.3.5 EdU 分析 使用 EdU(5 乙炔基-2-脱氧尿嘧啶核苷)检测试剂盒(RiboBio 有限公司,中国)来测量细胞生长。首先,将转染的细胞接种在 6 孔板的每个孔中,并培养 24 h。然后,用含有 EdU 的培养基替换培养基,并再培养 2 h。4%多聚甲醛固定细胞,用 Ap
22、ollo 溶液对 EdU 阳性细胞染色,并用Hoechst 试剂对 DNA 染色。最后进行荧光检测,Hoechst 显示蓝色荧光,最大激发波长为 346 nm,最大发射波长为 460 nm。细胞增殖的程度计算:EdU阳性率=EdU 阳 性 细 胞 数/DNA 染 色 细 胞 数 100%。1.3.6细胞周期分析用 siRNA 转染后,A549 细胞再孵育 48 h。加入含有 500 l 结合缓冲液,消化转染,室温下黑暗中孵育 15 min。使用膜联蛋白 V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)用膜联蛋白 V-FITC 和 PI 标记收集的细胞。
23、最后,在 1 h 内通过流式细胞仪(BDBiosciences,SanJose,CA,USA)检测细胞凋亡。1.4统计学处理使用 edgeR 软件包进行差异表达分析,以 Log2FC(T/N)2 或-2 及 P0.05 作为筛选条件,获取具有差异表达的基因。使用生存分析方法(如 Kaplan-Meier 曲线)评估目标 lncRNA的生存分析预后是否有显著差异。使用相关性分析方法:Spearman 秩相关系数。所有数据都采用 SPSS 24.0 软件进行分析,计量资料以xs 表示,2 组间比较用 t 检验,计数资料以例(%)表示,用2检验。2 结 果2.1 生物信息学分析获得 ceRNA 网络
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