猪初乳中PEDV IgA抗体捕获ELISA检测方法的建立及其初步应用.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 8 期2023 年 8 月Vol.45,No.8Aug.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202210004猪初乳中PEDV IgA抗体捕获ELISA检测方法的建立及其初步应用杨利1,2,张浩明1,2,于晓明1,2,侯立婷1,2,郑其升1,2*(1.江苏省农业科学院 动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心/江苏省食品质量与安全重点实验室,江苏 南京 210014;2.兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心,江苏 泰州 2
2、25300)摘要:为建立评价猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗免疫效力的方法,本研究利用纯化的PEDV免疫BALB/c小鼠,按照常规方法制备PEDV全病毒单克隆抗体(MAb)作为捕获抗体,PEDV细胞培养上清为夹心抗原,HRP标记的羊抗猪IgA为二抗,采用棋盘滴定法对各反应条件优化后建立了用于猪初乳中PEDV IgA检测的捕获ELISA方法,并确定其临界值为0.25。采用该捕获ELISA对PEDV、PCV2b、PRRSV、PRV、JEV、PPV、FMDV与CSFV IgA抗体阳性猪初乳进行检测,结果显示,除PEDV IgA抗体阳性猪初乳检测结果为阳性外,其他病毒抗体阳性猪初乳检测结果均为阴性,表
3、明该方法特异性强。采用该方法和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对从1颐10开始2倍倍比稀释的16个稀释度的阳性猪初乳样品检测,结果显示该方法对阳性样品检测的最大稀释度为1颐40 960,是BIONOTE PEDVIgA试剂盒敏感性的16倍(1颐2 560),表明本研究建立方法的敏感性高。分别采用同一批次和不同批次制备的MAb包被的ELISA板分别检测5份PEDV IgA抗体阳性和1份PEDV IgA抗体阴性猪初乳,评估该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数分别为0.34%4.49%和1.90%8.71%,均小于10%,重复性好。利用该捕获ELSIA和IDEXX PEDV
4、 IgA 抗体试剂盒分别对50份猪初乳检测,结果显示两种方法对样品检测的OD450nm值趋势高度一致,表明该方法检测结果与IDEXX试剂盒相关性强。利用该捕获ELISA和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对100份临床采集的猪初乳样品检测,结果显示二者总体符合率为97.0%。利用该方法对90份免疫背景不同的猪初乳检测,结果显示,未感染PEDV且未免疫PED疫苗的母猪初乳检测结果均为阴性结果,感染了PEDV或接种过PED疫苗的母猪初乳均为阳性结果,检测结果与样品的免疫背景相符。本研究建立的捕获ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,与同类进口产品检测结果符合率高,对临床样品的检测结果与其
5、免疫背景相符。本研究为PEDV感染猪初乳的检测及PED疫苗免疫效力的评价提供了一种新的技术手段。关键词:猪流行性腹泻病毒;IgA检测;捕获ELISA;猪初乳中图分类号:S852.65文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)08-0822-07Establishment and application of capture ELISA method for PEDVIgA detection in porcine colostrumYANG Li1,2,ZHANG Hao-ming1,2,YU Xiao-ming1,2,HOU Li-ting1,2,ZHENG Qi-sheng1,
6、2*(1.Institute of Veterinary Immunology&Engineering,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/National Research Center of Engineering andTechnology for Veterinary Biologicals/Jiangsu Key Laboratory for Food Quality and Safety,Nanjing 210014,China;2.GuoTai(Taizhou)Center of Technology Innovation for V
7、eterinary Biologicals,Taizhou 225300,China)收稿日期:2022-10-05基金项目:十四五重点研发专项(2022YFD1800800);江苏省农业自主创新资金CX(21)3135;江苏现代农业产业化单项技术研发CX(20)3096作者简介:杨利(1985-),女,重庆潼南人,助理研究员,硕士,主要从事兽药及动物疫病检测试剂盒开发.*通信作者:E-mail:immun_*Corresponding authorAbstract:To evaluate the efficacy of PEDV vaccine,a capture ELISA for PED
8、V IgA detection in colostrum was established byusing anti-PEDV monoclonal antibody(MAb)as coating antibody,cell cultures of PEDV as a capture antigen and a goatanti-porcine IgA as secondary antibody.Subsequently,the sensitivity,specificity,repeatability and coincidence rate of the captureELISA were
9、determined.The porcine colostrum with IgA anti-PEDV,PCV2b,PRRSV,PRV,JEV,PPV,FMDV and CSFV wasdetected by the capture ELISA,and the results showed that only the colostrum with IgA anti-PEDV was positive,while thecolostrum with IgA anti-other viruses were negative,indicating good specificity of this m
10、ethod.Besides,capture ELISA andBIONOTE PEDV IgA kit were used to detect positive samples with a 2-fold ratio dilution,respectively.The results showed that themaximum dilution of samples detected positive by this method was 1颐40960,which was 16 times that of BIONOTE PEDV IgA kit(1颐2560),showing that
11、the method established in this study was highly sensitive.The intra-batch and inter-batch coefficients ofvariation of this method were 0.34%-4.49%and 1.90%-8.71%,respectively,illustrating good repeatability of this method.CaptureELISA and BIONOTE PEDV IgA kit were used to detect 100 samples of porci
12、ne colostrum,and the compliance rate of the twomethods was 97.0%.The detection results of 50 porcine colostrum samples by capture ELSIA and IDEXX PEDV IgA kit showedthat the OD450nmvalue trend for the same group of samples detected by the two methods were highly consistent,indicating that theresults
13、 detected by this method correlated well with the IDEXX.The method was used to detect the 90 porcine colostrum sampleswith different immune background,and the results showed that the colostrum of sows not infected with PEDV and not vaccinatedagainst PEDV was negative,while that of sows infected with
14、 PEDV or vaccinated against PEDV was positive,demonstrating thatthe test results were consistent with the immunological background of samples.In summary,the capture ELISA method establishedin this study has good specificity,high sensitivity,good repeatability and high coincidence rate with similar p
15、roducts.The detectionresults of clinical samples were consistent with the immunological background and can be used to evaluate the efficacy of PEDvaccine.Key words:PEDV;IgA detection;capture ELISA;porcine colostrum猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由PED病毒(PEDV)引起的一种急性肠道传染病1,以腹泻、呕吐和脱水为主要临床特征,仔猪感染后
16、的死亡率高达50%100%2-4,给养猪业造成重大经济损失。新生哺乳仔猪感染PEDV后1 d2 d内即可引起严重腹泻,由于仔猪免疫系统发育不完善,无法迅速激起主动免疫应答,母源抗体提供的被动免疫是对抗该病的关键途径。仔猪通过吮吸初乳获得母源抗体,初乳中含大量的IgG和较多的IgA,但IgG分子量大且不能抵抗胃蛋白酶的消化作用,因此无法在 肠道抵 御PEDV的侵袭。猪 初 乳 中 分 泌 型 IgA(sIgA)是粘膜表面和大多数粘膜分泌物中的主要免疫球蛋白,能抵御胃蛋白酶的消化5,可进入仔猪肠道对抗PEDV的侵袭。已有文献报道初乳中IgA的含量(而非IgG的含量)与PEDV的攻毒保护效果呈正相关
17、6,并认为初乳中PEDV特异性IgA抗体的水平是评价仔猪被动免疫效力的关键因素7-8。因此,建立一种测定初乳中PEDV IgA的方法对母猪PED疫苗免疫效力评价、哺乳仔猪免疫程序制定、疾病流行监测均具有重要意义。目前已报道用于检测初乳中PEDV IgA抗体的方法主要为病毒中和试验9和间接ELISA法10-12。病毒中和试验检测的是初乳中PEDV的所有抗体(包括IgG、IgA、IgM等),而非单独的IgA。ELISA因其简单快速高通量等优点被广泛用于血清等体液中抗体的 检 测13-14。但 用 于 检 测 PEDV IgA 抗 体 的 间 接ELISA法大多采用重组蛋白作为包被抗原,表位单一、不
18、能完全模拟天然病毒,导致检测准确度下降。捕获ELISA如果是采用特异性单克隆抗体(MAb)捕获全病毒后进行抗体检测,准确度会更高,特异性更强。因此,本研究以PEDV全病毒特异性MAb包被酶标板,以细胞培养的全病毒作为捕获抗原,通过条件优化建立了母猪初乳中PEDV IgA抗体检测的捕获ELISA方法,为PED疫苗免疫效力评价提供了一种特性强、准确度高的技术手段。1材料与方法1.1病毒、细胞、初乳样品及实验动物PEDV NJ杨利,等.猪初乳中 PEDV IgA 抗体捕获 ELISA 检测方法的建立及其初步应用第 8 期823株、Vero、SP2/0细胞、以及猪圆环病毒(PCV2b)、猪繁殖和呼吸障
19、碍综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性乙型脑炎病 毒 9JEV)、猪 瘟 病 毒(CSFV)、猪 口 蹄 疫 病 毒(FMDV)IgA抗体阳性猪初乳各1份(这些样品均为免疫过相关疫苗未免疫过PED疫苗的母猪初乳),以及PEDV IgA抗体阴性猪初乳50份、阳性猪初乳5份、PED疫苗免疫后猪初乳100份,均由江苏省农业科学院动物免疫工程研究所保存。BALB/c小鼠购自扬州大学比较医学中心。90份临床猪初乳来自四川某猪场(感染过PEDV,未免疫PED疫苗)、重庆某猪场(无PEDV感染病史,未免疫PED疫苗)及黑龙江某猪场(免疫过PED疫苗)。1.2主要试
20、剂BIONOTE PEDV IgA试剂盒购自韩国BIONOTE公司;IDEXX PEDV IgA抗体检测试剂盒购自IDEXX公司;HPR标记的羊抗猪IgA(IgA-HRP)购自艾博抗(上海)贸易有限公司;HRP标记的羊抗鼠IgG(IgG-HPR)、FITC标记的羊抗鼠IgG(IgG-FITC)购自武汉博士德生物工程有限公司;BSA、PEG、DMEM及TMB均购自Sigma-Aldrich公司。1.3PEDV MAb的制备与效价测定将采用蔗糖密度梯度离心获得的纯化PEDV用PBS 稀释至0.5 mg/mL,与等体积弗氏完全佐剂乳化,以200 滋L/只皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。此后将抗原量
21、减半与弗氏不完全佐剂乳化,以相同的方式分别在第21 d、28 d、35 d对小鼠加强免疫。以纯化的PEDV(0.1 滋g/孔)为包被抗原,以不同稀释度的小鼠血清为一抗,羊抗鼠IgG-HRP(1颐10 000)为二抗,经间接ELISA检测后取抗体效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0融合,采用江苏省农业科学院动物免疫工程研究所建立的间接免疫荧光试验(IFA)对融合后的杂交瘤细胞上清进行筛选。将获得的阳性杂交瘤细胞经腹腔注射经产母鼠制备腹水。采用ProteinG亲和纯化腹水获得PEDVMAb,采用上述间接ELISA测定MAb的效价、SDS-PAGE检测纯度,并将制备的PEDV MAb命名为10A4。1.
22、4捕获ELISA条件优化采用棋盘滴定法确定捕获MAb 10A4最佳 包被浓 度(8 滋g/mL、4 滋g/mL、2 滋g/mL、1 滋g/mL、0.5 滋g/mL),夹心抗原PEDV的最 佳 工 作 浓 度(106.6TCID50/mL、106.3TCID50/mL、106.0TCID50/mL、105.7TCID50/mL、105.4TCID50/mL)、最佳作用时间(30 min、60 min、90 min)。采用单因素变量法确定最佳包被液种类(50 mmol/L pH9.6CBS、10 mmol/L pH7.4 PBS、20 mmol/L pH8.0Tris-HCl);最佳封闭液种类(1
23、%BSA-PBST、1%明胶-PBST、10%小牛血清-PBST)、猪初乳最佳稀释度(1颐10、1颐20、1颐40、1颐80、1颐160、1颐320)、最佳反应时间(30 min、60 min)、HRP标记的羊抗IgA(IgA-HPR)最佳稀释度(1颐5 000、1颐10 000、1颐20 000、1颐40 000)、最佳作用时间(30 min、60 min)、显色液TMB最佳作用浓度(0.1 g/L、0.2 g/L、0.4 g/L)、最佳作用时间(5 min、10 min、15 min)。1.5临界值的确定选择50份未接种过PED疫苗的SPF猪初乳,采用优化后的的捕获ELISA方法检测OD4
24、50nm值,计算猪初乳平均OD450nm值 和标准差。根据公式:临界值cut-off=+3,计算该方法的临界值。1.6特异性试验采用本研究建立的捕获ELISA对PEDV、PRRSV、PPV、PRV、JEV、PCV2、FMDV、CSFV IgA抗体阳性猪初乳样品检测,评估该方法的特异性。实验设ddH2O为阴性对照。1.7敏感性试验选取1份PEDV IgA抗体阳性猪初乳,从1颐10开始2倍倍比稀释为16个稀释度(直至OD450nm值小于cut-off值),采用本研究建立的捕获ELISA和BIONOTE PEDV IgA试剂盒检测,比较二者的敏感性。1.8重复性试验采用同一批制备的MAb包被ELIS
25、A板,分别对5份PEDV IgA抗体阳性猪初乳和1份PEDV IgA抗体阴性猪初乳检测,每个样品重复5次,计算批内变异系数;采用不同批次制备的MAb包被ELISA板,分别对上述猪初乳样品检测,每个样品重复5次,计算批间变异系数。评估本研究建立的捕获ELISA方法的重复性。1.9捕获ELISA与BIONOT PEDV IgA 检测试剂盒的符合率试验采用本研究建立的捕获ELISA和BIONOT PEDV IgA检测试剂盒分别对100份PED疫苗免疫后猪初乳样品检测,统计两种方法检测的阳性样品及阴性样品数量。BIONOTE试剂盒检测为阳性的样品数量记为DP,检测为阴性的样品数量记为DN;两种方法检测
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