猪流行性腹泻病毒HeN21株的分离鉴定及致病性研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 11 期2023 年 11 月Vol.45，No.11Nov.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202211029猪流行性腹泻病毒HeN21株的分离鉴定及致病性研究冷超粮1*，贾楠1，翟洪月1，马秀秀1，田想1，宋佳静1，史鸿飞1，李娜1，姚伦广1，阚云超1，张瑞2*，田志军3(1.南阳师范学院 河南省动物疫病诊断与综合防控工程技术研究中心/昆虫生物反应器河南省工程实验室，河南 南阳 473061；2.河南省封丘县农业农村局，河南 封丘 453300；3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 动物疫病防控全国重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069)摘要：为了解河南地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行及变异情况，本研究从该地区某疑似感染PEDV的发病猪场采集粪便样品，经RT-PCR检测并测序，结果显示该猪场为PEDV感染。将阳性样品接种Vero细胞进行病毒分离，并通过RT-PCR扩增、测序及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定，结果显示分离到一株PEDV，命名为HeN21株。经PCR分段扩增病毒全基因组，测序、拼接后的结果显示，该病毒基因组全长28 036 bp。为进一步分析HeN21株的遗传演化特征，利用MegAlign分析HeN21株全基因组与GenBank中5株PEDV参考株全基因组序列的相似性；采用MEGA 11软件中NJ法构建HeN21株与GenBank中31株PEDV参考株S基因的系统发育树；采用MegAlign分析HeN21株S蛋白氨基酸序列的变异特征；进一步评价HeN21株对哺乳仔猪的致病性。相似性分析结果显示，HeN21株与PEDV参考株的相似性为96.6%98.9%，其中与经典GIa亚型代表株CV777的相似性最低为96.6%，与GIIa亚型代表株AH2012和GIIb亚型代表株AJ1102的相似性均为98.5%。进化树结果显示，HeN21株与GIIa亚型PEDV聚为一支。S蛋白氨基酸序列分析结果显示，与经典株CV777相比，HeN21株在中和抗原表位类胶原酶消化区(COE)存在11个氨基酸突变，其中K635T是其特有的突变。致病性试验结果显示，3日龄健康仔猪最早于接种HeN21株后12 h出现腹泻和呕吐，随后症状加重并死亡。感染组仔猪的直肠拭子经RT-PCR检测和PCR产物测序，全部为PEDV阳性，且小肠肠壁薄而透明，完全丧失消化吸收功能。上述结果表明，PEDV在我国持续变异，且分离株具有较强的致病性，应高度重视。本研究报道的PEDV分离株为深入了解河南地区PED的流行及防控具有重要意义，并进一步丰富了PEDV病毒库，为开发设计新型疫苗奠定了基础。关键词：猪流行性腹泻病毒；序列分析；遗传变异；致病性试验中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)11-1108-08Isolation,identification and pathogenicity of porcine epidemicdiarrhea virus HeN21 strainLENG Chao-liang1*,JIA Nan1,ZHAI Hong-yue1,MA Xiu-xiu1,TIAN Xiang1,SONG Jia-jing1,SHI Hong-fei1,LI Na1,YAO Lun-guang1,KAN Yun-chao1,ZHANG Rui2*,TIAN Zhi-jun3(1.Henan Provincial Engineering and Technology Center of Animal Disease Diagnosis and Integrated Control,Henan Provincial EngineeringLaboratory of Insects Bio-reactor,Nanyang Normal University,Nanyang 473061,China;2.Agricultural and Rural Bureau of Fengqiu County,Henan Province,Fengqiu 453300,China;3.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention,Harbin Veterinary ResearchInstitute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China)收稿日期：2022-11-15基金项目：河南省高等学校重点科研项目(22A230016)作者简介：冷超粮(1984-)，男，河南周口人，副教授，博士，主要从事猪病分子流行病学研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding authorAbstract:In order to study the prevalence and variation of porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)in Henan Province,fecalsamples collected from a suspected PEDV-infected pig farm were detected by RT-PCR.The amplicons were sequenced,whichshowed the PEDV infection in this pig farm.The positive samples were inoculated into Vero cells for virus isolation,followed byRT-PCR,sequencing,and indirect immunofluorescence assay(IFA).The results showed that a PEDV strain was successfullyisolated,which was designated HeN21.The full-length genome of the virus was 28036 nucleotides.To further analyze the geneticevolution characteristics of the HeN21 strain,MegAlign software was used to analyze the whole genome nucleotide similarityamong the HeN21 strain and five representative PEDV strains from GenBank.MegAlign was also used to analyze the S proteinamino acid sequence variation characteristics of the HeN21 strain.A phylogenetic tree by the NJ method using MEGA 11 softwarewas constructed based on the S gene among the HeN21 strain and 31 representative PEDV strains in GenBank.The pathogenicityof the HeN21 strain to suckling piglets was further evaluated.The results showed that the nucleotide similarities among the wholegenome and five representative PRRSV strains were 96.6%-98.9%,among which the similarity between the HeN21 strain andCV777 strain of GIa subtype was 96.6%,and that between the HeN21 strain and AH2012 of GIIa subtype or AJ1102 of GIIbsubtype was 98.5%.Phylogenetic tree results showed that the HeN21 strain and GIIa subtype PEDV were clustered into onebranch.The amino acid sequence analysis of the S protein showed that compared with the classical strain CV777,the HeN21 strainhad 11 amino acid mutations in the collagenase-digested fragment equivalent(COE)region of neutralizing epitope,of which K635Twas a unique mutation.The results of the pathogenicity test showed that 3-day-old healthy piglets began to develop diarrhea andvomiting at the earliest 12 hours after inoculation with the HeN21 strain,followed by aggravated symptoms and death.Rectalswabs of piglets in the infected group were all PEDV positive and were subjected to RT-PCR and sequencing.In addition,thesmall intestine walls of the piglets were thin and transparent,leading to the complete loss of digestion and absorption functions.These results indicate that PEDV in China continuously mutates,and the isolateis highly pathogenic.Thus,much attention shouldbe paid to the current situation.The PEDV strain reported in this study is significant for an in-depth understanding of PEDVprevalence and the control of PEDV transmission in Henan Province.At the same time,the isolated HeN21 strain further enrichedthe PEDV strain pool and laid a foundation for developing and designing novel PED vaccines.Key words:porcine epidemic diarrhea virus;sequence analysis;genetic variation;pathogenicity test猪 流 行 性 腹 泻 病 毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)是猪的一种肠道烈性传染性病毒，感染仔猪后临床表现为腹泻、呕吐、厌食和脱水等。尽管各年龄段猪均可以感染，但是PEDV对哺乳期仔猪的致病性最为严重，致死率高达100%1。1978年，PEDV首次在英国报道，随后在30多年时间里，PED在全球零星散发2-3。直到2010年12月，我国出现致病性增强的PEDV变异株，随后在北美、亚洲等地也不断出现，给全球养猪业造成了严重的经济损失4。PEDV是单股正链RNA病毒，分类上属于尼多病毒目()冠状病毒科()冠状病毒 属()的 琢 冠 状 病 毒 亚 属()5。PEDV基因组全长约28 kb，包含5端帽子结构(Cap)和3端Poly A尾，以及至少7个开放阅读框(ORF)。ORF1a和ORF1b约占基因组全长的2/3，编码非结构蛋白；ORF2ORF6分别编码结构蛋白包括纤突蛋白S、ORF3蛋白、包膜蛋白E、囊膜蛋白M和核衣壳蛋白N6。S蛋白是PEDV最主要的膜蛋白，介导病毒进入宿主细胞以及诱导产生中和抗体，被广泛用于基因工程疫苗以及抗体检测试剂盒研发的靶标7。目前，S蛋白表面鉴定出4个主要的中和抗原表位区，分别是胶原酶消化区(COE)(aa499aa638)、SS2表位(aa748aa755)、SS6表位(aa764aa771)和2C10表位(aa1368aa1374)8-9。此外，S基因常用于监测病毒的变异，并根据其差异性，可将PEDV分为经典株(GI)和变异株(GII)两种类型10。为了解我国河南地区PEDV的流行及变异情况，本实验室于2021年4月从河南省南阳市某规模化猪场发生腹泻的仔猪肠道样品中检测出PEDV，在Vero细胞中分离出1株可以稳定传代的GII型PEDV，命名为HeN21。通过对该株病毒的全基因组测序，与其他PEDV参考株全基因组的序列比对和S1基因进化树分析，分析PEDV在河南地区的流行趋势，并开展该病毒的动物回归试验，研究其致病性，并为PED的防控提供参考依据。冷超粮，等.猪流行性腹泻病毒HeN21株的分离鉴定及致病性研究第 11 期11091材料与方法1.1病料样品、细胞及实验动物2021年4月，河南省南阳市某规模化猪场发生疑似PED疫情，采集发病仔猪的肠道样品于-80 保存备用；Vero细胞和PEDV cDNA由本实验室保存；10只3日龄健康仔猪购自黑龙江省某商品化猪场，经检测确认PEDV抗原和抗体均为阴性。1.2主要试剂病毒基因组提取试剂盒购自杭州博日科技股份有限公司；质粒提取和胶回收试剂盒购自OMEGA公司；高保真PCR酶、pMD18-T载体均购自TaKaRa公司；FITC标记的羊抗鼠IgG购自北京康为世纪生物科技有限公司；PEDV IgG ELISA抗体检测试剂盒购自武汉科前生物股份有限公司；PEDV M蛋白单克隆抗体(MAb)由本实验室制备并保存。1.3引物 的设计 与合 成根据 GenBank中 PEDVAJ1102株(JX188454)的全基因组序列，利用Primer5.0软件设计14对PEDV全基因组扩增引物和1对检测引物(表1序号115)。此外，设计分别扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的检测引物(表1序号1620)。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。位置(nt)Position(nt)1-20551961-40553924-59975922-79687892-99409868-1192411844-1388413807-1585615780-1782817758-1982419749-2180921728-2376923706-2575425687-28037/片段大小(bp)Product sizes(bp)20552095207420472049205720412050204920672061204220492351208912001100603618329退火温度()Annealing temperature()5254535153515453555253525355555055565655表1本研究中所用引物引物名称Primer namePEDV-A(52/2055)-FPEDV-A(52/2055)-RPEDV-B(54/2095)-FPEDV-B(52/2095)-RPEDV-C(53/2074)-FPEDV-C(53/2074)-RPEDV-D(51/2047)-FPEDV-D(51/2047)-RPEDV-E(53/2049)-FPEDV-E(53/2049)-RPEDV-F(51/2057)-FPEDV-F(51/2057)-RPEDV-G(54/2041)-FPEDV-G(54/2041)-RPEDV-H(53/2050)-FPEDV-H(53/2050)-RPEDV-I(55/2049)-FPEDV-I(55/2049)-RPEDV-J(52/2067)-FPEDV-J(52/2067)-RPEDV-K(53/2061)-FPEDV-K(53/2061)-RPEDV-L(52/2042)-FPEDV-L(52/2042)-RPEDV-M(53/2049)-FPEDV-M(53/2049)-RPEDV-N(55/2351)-FPEDV-N(55/2351)-RJC-PEDV(55/2089)-FJC-PEDV(55/2089)-RJC-TGEV(50/1200)-FJC-TGEV(50/1200)-RPoRV-VP7(1100)-FPoRV-VP7(1100)-RJC-GP5(56/603)-FJC-GP5(56/603)-RCSFV(56/618)-FCSFV(56/618)-RJC-PCV2(55/329)-FJC-PCV2(55/329)-R引物序列(5-3)Primer sequences(5-3)ACTTAAAAAGATTTTCTATCTACTTATAAACAGGATGTTCAATGACAGTTGTTGTTGATGGACTTGCACCACTATCCTTGCCTATAAAAGTCGAGATACTACTGCTCTCTCCTCCATCATGCACCATACCAGTGCATTCCTAGATAATGGTAACGGGTCATAATCACTATCACTGCTATGTTCATAGTTGTTGTTTTCTTTAAGCCACCAGGTAGAACCATTAGTAGTCTGTTTACAGAGAATGATGCCATCTCCTTCTGCCTTAAGCGTATTGTCAAGCTCCAGAATAAGTAAGCTCAGAACCCTCAGAAACCTGGCCATTTCAATAAGGATCTTTAGGTCCTACAACCTCATACTATCAAGGCCAAGGAGGAGACGTATGCAGCGCACTATTGTAATCAAGATTGGACCAAGTAAGAGCAGCGCCATAGTTATAGAGATTGGTTATTCCATGCCTTCTATTTGAGGTAAAACAGCCAAAAATTTGCTACCCAAGTACCCTATTATTGCCCTGCGAGTTAACAACCTCTTGCCAAGGGTTTGAACACTGTGGCGATATTCCATGTGAAATTCCAGATGTCTAACGGTTCTATTCCCGGTGTATCCATATCAACACCGTCATGAAGTCTTTAACCTACTTCTGGTCAGAATAAACAGCACCACTAGTGAACTAAACTTCTAAATGGCTTAGTTCGTTACCTCATCGGCTTTAAAAGAGAGAATTTCGGTCACATCATACAGTTCTAACATGTTGGGGAAGTGCTTGACCCTAGAGACGACCCCATTGTTCGGCTGTCCTGTAAGGAAGCACTTGCATTGTTTTACTTGCCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCGCCTACGTGGTCTACATTCCC序号No.1234567891011121314151617181920中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年11101.4腹泻仔猪肠道样品的PCR检测将采集的5份发病仔猪道样品剪碎，加入PBS缓冲液研磨后离心，取上清液于0.22 滋m微孔滤器过滤。取200 滋L滤液，利用病毒基因组提取试剂盒提取RNA，反转录为cDNA后和提取的DNA分别作为模板，以本实验室保存的PEDV cDNA作为阳性对照，灭菌水作为阴性对照，采用表1中的JC-PEDV(55/2089-F/P)经PCR检测。PCR反应条件为：95 5 min；95 1 min、50 56 30 s、72 1 min，共35个循环；72 10 min。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。1.5病毒的分离、鉴定、传代及病毒滴度的测定将上述PCR扩增为PEDV阳性病料样品的上清液接种6孔板中培养的单层Vero细胞中，置于37、5%CO2培养2 h，弃上清，加入含终浓度5 滋g/mL胰酶的DMEM培养基，每日观察细胞病变(CPE)。待细胞出现典型CPE时，收集病毒液，反复冻融后再次接种正常Vero细胞，进行病毒传代。收集第5代(F5)的病毒液提取病毒RNA，反转录为cDNA作为模板，利用表1中的PEDV检测引物JC-PEDV(55/2089)-F/R经PCR鉴定，PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。固定F5代出现CPE的Vero细胞，并设不接种病毒的Vero细胞为阴性对照。以PEDVM蛋白MAb(1颐100)为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG(1颐100)为二抗，利用间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。将F5代病毒液10倍倍比稀释后接种96孔板中的单层Vero细胞，每个稀释度的病毒液接种8个孔，置于37、5%CO2培养箱孵育5 d，经Reed-Mench法测定病毒液的TCID50。1.6分离病毒全基因组的PCR扩增、测序及序列分析取上述F5代病毒液的cDNA作为模板，通过表1中的引物经PCR分段扩增分离病毒的全基因组。PCR反应条件为：95 5 min；95 1 min、51 55 30 s、72 2 min，共35个循环；72 10 min。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果利用DNAStar软件包中的Seq拼接得到完整的病毒全基因组序列。利用DNAStar软件包中的MegAlign将获得的分离株全基因组与GenBank中5株PEDV参考株(CV777、AJ1102、AH2012、OH851和TRS2021)全基因组序列比对后，分析分离病毒全基因组序列的相似性。利用MEGA 11软件中的NJ(Neighbor-joining)邻近法构建分离株与GenBank中PEDV参考株S基因(31株参考株)的系统发育树，对系统发育树的Bootstrap值进行1000次重复以评估系统进化树分支的置信度。采用MegAlign软件分析分离株S蛋白抗原表位氨基酸序列的变异特征。1.7分离病毒对仔猪的致病性试验将10只3日龄PEDV抗原和抗体均为阴性的健康仔猪随机分为感染组(=5)和对照组(=5)。实验猪全部饲喂于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所P2实验动物房。感染组 仔 猪 口 服 接 种 2 mL/只 PEDV HeN21 病 毒 液(105.5TCID50/mL)，对照组仔猪口服2 mL/只DMEM培养基。于感染后12 h观察各组猪的临床症状，并采集各组仔猪的直肠拭子，采用表1中的PEDV检测引物JC-PEDV(55/2089)-F/R经PCR检测。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。在接种PEDV 3 d后，剖杀所有仔猪并观察其剖检病变。2结果2.1腹泻仔猪肠道样品的PCR检测结果对采集的5份发病仔猪小肠样品经RT-PCR检测，结果显示，有3份样品在2 089 bp处出现目的条带(图1)，PCR产物测序结果显示为PEDV阳性。同时TGEV、PoRV、PRRSV、CSFV和PCV2等病原均为阴性。结果表明，该猪场猪发生腹泻的病原为PEDV。2.2病毒的分离鉴定将3份鉴定为PEDV阳性的病料样品滤液分别接种Vero细胞并连续传代以分离病毒。结果显示，传代至F2代，1份接种样品的细胞出现典型的CPE，表现为细胞融合、轮廓消失并最终死亡脱落(图2A)。收获其F5代病毒液分别采用RT-PCR和IFA鉴定。PCR结果显示，扩增出2 089 bpM：DNA分子质量标准；15：仔猪肠道样品；6：阴性对照；7：阳性对照M:DL2000 DNA Marker;1-5:Clinical samples;6:Negative control;7:Positive control for PEDV图1仔猪肠道样品的PEDV的RT-PCR检测结果冷超粮，等.猪流行性腹泻病毒HeN21株的分离鉴定及致病性研究第 11 期11112000bp1000bpM1234567的目的条带，与2.1的PCR结果一致；IFA结果显示，病毒感染的Vero细胞出现特异性绿色荧光，而正常Vero细胞无该绿色荧光(图2C)。结果表明，本研究分 离 获 得 了 1 株 PEDV，将 其 命 名 为 HeN21。经Reed-Muench法计算病毒滴度结果显示，HeN21分离株的滴度为105.5TCID50/mL。2.3PEDV HeN21株全基因组的PCR扩增及相似性分析结果取2.2中提取的F5代HeN21病毒液cDNA作为模板，经PCR分段扩增、测序并经Seq拼接后获得全长为28 036 nt的全基因组序列。相似性分析结果显示，HeN21株全基因组序列与5株PEDV参考株全基因组序列的相似性为96.6%98.9%，其中与经典GIa亚型代表株CV777的相似性最低为96.6%，与变异GIIa亚型代表株AH2012和GIIb亚型代表株AJ1102的相似性均为98.5%，表明HeN21株属于GII型变异株。2.4PEDV HeN21株S基因遗传进化分析结果利用MEGA11进化分析软件，将HeN21株S基因与Gen-Bank中31株PEDV参考株S基因构建进化树。结果显示，PEDV株分为GI和GII两个基因型，前者进一步分为GIa和GIb两个基因亚型，后者进一步分为GIIa、GIIb和GIIc 3个基因亚型。HeN21株与GIIa亚型PEDV聚为一个分支(图3)，表明其属于GIIa亚型PEDV。2.5PEDV HeN21株S蛋白抗原表位序列氨基酸的分析为进一步分析HeN21株的分子特征，利用Me-gAlign软件分析HeN21株与26株PEDV参考株S蛋白氨基酸序列。结果显示，与经典株GIa亚型代表株CV777相比，HeN21株在中和抗原表位COE区存在11个氨基酸突变，其中A522S是GIIa和GIIc亚型PEDV特有的突变，而K635T是HeN21株特有的突变。在SS6中和抗原表位区，存在一个氨基酸突变，为Y771S(图4)。在SS2和2C10中和抗原表位区，不存在氨基酸的变异。以上结果表明，HeN21株S蛋白氨基酸序列既有GIIa亚型PEDV的共有分子特征，又有自己独特的分子特征。2.6分离病毒对仔猪的致病性试验结果将HeN21株感染3日龄PEDV抗原和抗体均为阴性的健康仔猪以分析其致病性。结果显示，感染组仔猪最早在接种PEDV HeN21后12 h开始出现水样腹泻和呕吐，在24 h36 h腹泻和呕吐症状加重，并开始死亡，在60 h全部脱水死亡。在整个实验过程中，对照组仔猪均存活，且未出现腹泻或其他临床症状(图5A)。A：HeN21接种Vero细胞后出现的CPE；B：正常细胞对照；C：HeN21接种Vero细胞后的IFA结果；D：IFA阴性对照A:CPE results of Vero cells inoculated with the HeN21;B:NormalVero cells;C:IFA results of Vero cells inoculated with the HeN21;D:Negative control of IFA图2PEDV的分离及鉴定结果荫：分离株HeN21 荫:HeN21 isolate图3基于S基因构建的PEDV HeN21与其他参考株的遗传进化树ABCDKJ960180 VNKCHY-310113-2013 SJX647847 GD-1 SKU646831 AH2012-12 SKJ158152 AH-M SJX188454 AJ1102 SKT021227 YN1 SKR818832 XY2013 SKJ020932 CHYJ130330 SKC210145 AH2012 SKF760557 CHJX-12013 SKC210147 JS-HZ2012 SKU237228 SS SKJ662670 KNU-1305 SKF272920 USAColorado2013 SKU237229 WZ1KU237217 HJ SOL762461 TRS2021 SHeN21 SKU237222 MZ SKT199103 CHHNLH2015 SKM609211 PEDV-LS SKU847996 ZL29 SKJ399978 OH851 SKR610991 EAS1 SKM887144 CHM2013 SAF353511 CV777 SJQ023161 virulent DR13 SKC109141 JS2008 SJX560761 SD-M SJQ023162 attenuated DR13 SKX534205 JSLS-12015 SKT323979 attenuated CV777 S0.01100100100100100100100100809899847561809399999963GIbGIaGIIcGIIaGIIb中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1112图4PEDV HeN21株与参考株S蛋白氨基酸序列的比对分析结果将采集的猪直肠拭子经RT-PCR检测和PCR产物测序。结果显示，在接种HeN21株12 h后，感染组仔猪直肠拭子全部为PEDV阳性。对照组仔猪直肠拭子在整个实验过程均为PEDV阴性。临床剖检结果显示，感染组仔猪小肠的肠壁薄而透明，完全丧失消化吸收功能。对照组仔猪的小肠及其他器官均未见明显剖检病变(图5B)。以上结果表明，HeN21分离株对哺乳仔猪具有较强的致病性。3讨论2010年年底以来，PEDV变异株在全球不断出现，成为威胁哺乳仔猪生长的最主要烈性传染性病毒4。近年来，针对PED的诊断、抗体治疗以及针对PEDV抗病毒药物研究方面均有一定的进展，但主要通过有效的疫苗免疫和严格的生物安全措施两方面防控PED11-13。PED的商品化疫苗主要有基于经典株CV777的弱毒疫苗、变异株AJ1102的弱毒疫苗和灭活疫苗，但这些疫苗只能通过肌肉注射免疫，冷超粮，等.猪流行性腹泻病毒HeN21株的分离鉴定及致病性研究第 11 期1113A：各组仔猪在感染后不同时间的存活率；B：感染组仔猪小肠的剖检病变；C：对照组仔猪的小肠A:Survival rates of piglets in eachgroupsat different times after infection;B:Small intestine lesions of the piglets in the infection group;C:Small intestines of the piglets in control group图5PEDV HeN21株对仔猪的致病性试验结果Hours post infectionPEDV HeN21Control150100500806040200ABCKJ960180 VNKCHY-310113-2013 S.proKM609211 PEDV-LS S.proKJ399978 OH851 S.proKU847996 ZL29 S.proKU646831 AH2012-12 S.proKT021227 YN1 S.proKR818832 XY2013 S.proKJ020932 CHYJ130330 S.proJX647847 GD-1 S.proJX188454 AJ1102 S.proKT199103 CHHNLH2015 S.proKC210145 AH2012 S.proAF353511 CV777 S.proKR610991 EAS1 S.proJQ023161 virulent DR13 S.proKT323979 attenuated CV777 S.proKC109141 JS2008 S.proJX560761 SD-M S.proJQ023162 attenuated DR13 S.proKX534205 JSLS-12015 S.proKJ158152 AH-M5 S.proHeN21 S.proOL762461 TRS2021 S.proKF760557 CHJX-12013 S.proKC210147 JS-HZ2012 S.proKJ662670 KNU-1305 S.proKF272920 USACobrado2013 S.proGIIcGIIbGIIaGIbGIaMajorityHHHHHHHHHHHHHHHHHHQHHHHHHGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIISSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSEEEEEEEEEDDYEEEEEEEEEEEEEEFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVDSDDDDSSSSSSSSSSSSSSSSSSQQQQQQPLLLLLRNNPTSSSSSSSSSSSGTRVSAAFGGHSGANLIASLFYNVTNSYGYVSKSQSAPEFGSGVKFTSLYFQFTKGELITGTPKPLEGVTPSQSGVSAAFGGLSSANLVA TLFYNVTNSYGYVSKSQGA PAFGSGVKLTSLYFQFTKGELITGTPKPLEGITPSQYG520530560570 600 610620630640770SS6COE且仅能诱导猪产生IgG抗体和低水平的IgA抗体，而PEDV主要通过猪的口鼻腔等的粘膜接触感染，因此亟需开发出能诱导产生高水平IgA抗体的新型疫苗14。国内外很多规模化猪场通过“返饲”的方式，使母猪感染PEDV野毒后产生高水平的IgG和IgA抗体，哺乳仔猪通过被动免疫获得这些抗体，从而免受PEDV的感染。这是一种有效的预防PED的措施，但存在病毒传播的风险1。此外，PEDV近年来持续变异和重组，给PED的防控带来了更为严峻的挑战15。本研究在Vero细胞中分离出1株PEDV变异株HeN21，并获得了其全基因组序列。序列分析结果显示，HeN21株与经典株CV777的相似性较低，为96.6%，与早期变异株AJ1102和AH2012的相似性均为98.5%，而与去年出现的变异株TRS2021的相似性达98.9%，这些结果表明PEDV不断变异，需持续监测和分析。S基因编码的纤突蛋白位于病毒粒子的最外层，常用于监测PEDV变异和基因分型10。本研究基于S基因的进化树分析显示，PEDV可分为GIa、GIb、GIIa、GIIb和GIIc 5个基因亚型，与Guo等的报道一致15。GIa亚型主要包括早期出现的CV777和DR13株，GIb包括通过细胞传代致弱形成的CV777和DR13活疫苗株，以及一些中国和韩国的流行株。2010年以来出现的PEDV主要属于GII亚型，其中GI-Ia亚型主要是美国流行株，GIIb亚型包括中国、韩国和日本等亚洲国家的流行株，而GIIc亚型于2012年以来开始增多，最早在欧洲发现，随后在美国和中国流行，可能是GIa和GIIa亚型的重组株15。尽管PEDV 5种不同基因亚型PEDV在我