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微生物限度检测方法验证操作规程
1　 目的
确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。
2　 依据
《中国药典》2023版。
3　 范围
所有需进行微生物限度检测的产品。
4　 责任
4.1　 验证小组负责检查方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实行。
4.2　 验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。
5　 程序
5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完毕后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案实验。
5.2 实验完毕后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实行。
6 内容
6.1 概述
通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。根据样品特性制订检查方法和检查条件，按制定的方案进行实验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检查方法和检查条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证
6.2.1 验证用菌株
铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]
黑曲霉[CMCC（F）98 003]
白色念珠菌[CMCC（F）98 001]
6.2.2 验证用菌液制备
6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。
6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。
6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃培养5～7天，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液，备用。
6.2.3 供试液的制备
6.2.3.1 水溶性供试试品
取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品
取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
6.2.3.3 油脂类供试品
取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充足混匀。表面活性剂的温度一般不超过40℃（特殊情况下，最多不超过45℃），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释液使成1：10供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释液进一步10倍系列稀释。
6.2.3.4 肠溶制剂供试品
取供试品10g，加入pH6.8无菌磷酸盐缓冲液，置45℃水浴中，振摇，使溶解，制成1：10的供试液。必要时，用一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
6.2.4 接种和稀释
按下列规定进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收实验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1％。为确认供试品中的微生物能被充足检出，一方面应选择最低稀释级的供试液进行计数方法合用性实验。
6.2.4.1 实验组 取上述制备好的供试液，加入实验菌液，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。
6.2.4.2供试品对照组 取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同实验组操作。
6.2.4.3 菌液对照组 取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液代替供试液，按实验组操作加入实验菌液并进行微生物回收实验。
若因供试品抗菌活性或溶解性较差的因素导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法合用性实验时，应采用适宜的方法对供试液进行进一步的解决。假如供试品对微生物生长的克制作用无法以其他方法消除，供试液可通过中和、稀释或薄膜过滤解决后再加入实验菌悬液进行方法合用性实验。
6.2.5 抗菌活性的去除或灭活
供试液接种后，按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数。若实验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌落数值的50％，可采用下述方法消除供试品的抑菌活性。
6.2.5.1 增长稀释液或培养基体积。
6.2.5.2 加入适宜的中和剂或灭活剂。
中和剂或灭活剂（表1）可用于消除干扰物的抑菌活性，最佳在稀释液或培养基灭菌前加入。若使用中和剂或灭活剂，实验中应设中和剂或灭活剂对照组，即取相应量稀释液替代供试品同实验组操作，以确认其有效性和对微生物无毒性。中和剂或灭活剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.5～2范围内。
表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法
干扰物
可选用的中和剂或灭活方法
戊二醛、汞制剂
亚硫酸氢钠
酚类、乙醇、醛类、吸附物
稀释法
醛类
甘氨酸
季铵化合物、对羟基苯甲酸、双胍类化合物
卵磷脂
季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸
聚山梨酯
水银
巯基醋酸盐
水银、汞化物、醛类
硫代硫酸盐
EDTA、喹喏酮类抗生素
镁或钙离子
磺胺类
对氨基苯甲酸
-内酰胺类抗生素
-内酰胺酶
6.2.5.3 采用薄膜过滤法。
6.2.5.4 上述几种方法的联合使用。
若没有适宜消除供试品抑菌活性的方法，对特定实验菌回收的失败，表白供试品对该实验菌具有较强抗菌活性，同时也表白供试品不易被该类微生物污染。但是，供试品也也许仅对特定实验菌株具有克制作用，而对其他菌株没有克制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检查结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行计数方法合用性实验。若方法合用性实验符合规定，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检查。
6.2.6 供试品中微生物的回收
计数方法合用性实验用的各实验菌应逐个进行微生物回收实验。微生物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法或MPN法。
6.2.6.1 平皿法 平皿法涉及倾注法和涂布法。每株实验菌每种培养基至少制备2个平皿，从算术平均值作为计数结果。
6.2.6.1.1 倾注法 取照上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活” 制备的供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿可，注入15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应培养加。按表1规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各实验组的平均菌落数。
6.2.6.1.2 涂布法 取15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注入直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养基表面干燥。若使用直径较大的平皿，培养基用量也应相应增长。每一平板表面接种上述照“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活” 制备的供试液不少于0.1ml。按表1规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各实验组的平均菌落数。
6.2.6.2 薄膜过滤法 薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于0.45µm，直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。供试品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物的截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充足干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免薄膜上的微生物受损伤。
取照上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活” 制备的供试液适量（一般取相称于1g、1ml或10 cm2的供试品，若供试品中所含的菌数较多时，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液中，混匀，过滤。用适量的冲洗液冲洗滤膜。
若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。按表1规定条件培养、计数。每株实验菌每种培养基至少制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
6.2.6.3 MPN法 MPN法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿法，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，本法不合用霉菌计数。若使用MPN法，按下列环节进行。
取照上述 “供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活” 制备的供试液至少3个连续稀级，每一稀释级取3份1ml分别接种至3管装有9～10ml胰酪大豆胨液体培养基中，同法测定菌液对照组菌数。必要时可在培养基中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂。
接种管置30～35℃培养3天，逐日观测各管微生物生长情况。假如由于供试品的因素使得结果难以判断，可将该管培养物转种至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基，在相同条件下培养1～2天，观测是否有微生物生长。根据微生物生长的管数从表2查被测供试品每1g或1ml中需氧菌总数的最也许数。
表2 微生物最也许数检索表
生长管数
需氧菌总数最也许数
95﹪置信限
每管含样品的g或ml数
MPN/g或ml
下限
上限
0.1
0.01
0.001
0
0
0
〈3
0
9.4
0
0
1
3
0.1
9.5
0
1
0
3
0.1
10
0
1
1
6.1
1.2
17
0
2
0
6.2
1.2
17
0
3
0
9.4
3.5
35
1
0
0
3.6
0.2
17
1
0
1
7.2
1.2
17
1
0
2
11
4
35
1
1
0
7.4
1.3
20
1
1
1
11
4
35
1
2
0
11
4
35
1
2
1
15
5
38
1
3
0
16
5
38
2
0
0
9.2
1.5
35
2
0
1
14
4
35
2
0
2
20
5
38
2
1
0
15
4
38
2
1
1
20
5
38
2
1
2
27
9
94
2
2
0
21
5
40
2
2
1
28
9
94
2
2
2
35
9
94
2
3
0
29
9
94
2
3
1
36
9
94
3
0
0
23
5
94
3
0
1
38
9
104
3
0
2
64
16
181
3
1
0
43
9
181
3
1
1
75
17
199
3
1
2
120
30
360
3
1
3
160
30
380
3
2
0
93
18
360
3
2
1
150
30
380
3
2
2
210
30
400
3
2
3
290
90
990
3
3
0
240
40
990
3
3
1
460
90
1980
3
3
2
1100
200
4000
3
3
3
〉1100

注：表内所列检查量如改用1g(或ml)，0.1g (或ml)和0.01g（或ml）时，表内数字应相应减少10倍；如改用0.01g（或ml）、0.001 g(或ml)和0.0001 g（或ml）时，表内数字应相应增长10倍，其余类推。
6.2.7 结果判断 计数方法合用性实验中，采用平皿法或薄膜过滤法时，实验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值在0.5～2范围内；采用MPN法时，实验组菌数应在菌液对照组菌数的95﹪置信限内。若各实验菌的回收实验均符合规定，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。
方法合用性确认时，若采用上述方法还存在一株或多株实验菌的回收达不到规定，那么选择回收最接近规定的方法和实验条件进行供试品的检查。
6.3 控制菌检查方法验证
6.3.1验证用菌株
大肠埃希菌[CMCC（B）44 102]
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]
沙门菌[CMCC(B) 50 094]
铜绿假单胞菌[CMCC (B) 10 104]
白色念珠菌[CMCC（F）98 001]
6.3.2菌液制备
将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30℃～35℃培养18～24小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，20℃～25℃培养2～3天，上述培养物用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或0.9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2℃～8℃，可在24小时内使用。
6.3.3 供试液的制备（同6.2.3）
6.3.4 验证方法
6.3.4.1实验组
6.3.4.1.1 实验菌 根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应实验菌株，确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时，采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为实验菌。
6.3.4.1.2常规法 取规定量的供试液和不大于100cfu的实验菌接入规定的培养基中，按《微生物限度检查标准操作规程》中控制菌的检查法进行检查。
6.3.4.1.3培养基稀释法 供试品有抑菌作用，放大培养基量，由于容器体积限制，一般不超过1000ml。
6.3.4.1.4薄膜过滤法 采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，实验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。每张滤膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。
6.3.4.1.5中和法 在供试品溶液中加入相应的中和剂，以减除供试品中抑菌成分的作用，中和剂应对微生物无毒性，与抑菌成分结合后的产物应对微生物亦无毒性，或有毒性但不影响待检菌的检出。
6.3.4.2阳性对照组 取不大于100cfu的实验菌接入规定的培养基中，按《微生物限度检查标准操作规程》中控制菌的检查法进行检查。
6.3.4.3阴性对照组 取相应的稀释液替代供试液，按《微生物限度检查标准操作规程》中控制菌的检查法进行检查。
6.3.5 结果判断
在实验中，阳性对照组应检出实验菌，阴性对照组应无菌生长。若实验组检出实验菌，按此供试液制备方法和控制菌检查方法进行该供试品控制菌的检查；若实验组未检出实验菌，应采用自然沉降法、培养基稀释法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。假如通过实验确证供试品对实验菌的抗菌作用无法消除，可认为受克制的微生物不易存在于该供试品中，选择抑菌成分消除相对彻底的方法进行供试品的检查。
6.3.6验证结论的应用：应按《验证结论确认操作规程》执行。
7 相关文献
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