RAD-seq技术研究鹅掌...属种源遗传多样性和遗传结构_潘文婷.pdf

第 58 卷 第 4 期2 0 2 2 年 4 月林业科学SCIENTIASILVAESINICAEVol.58,No.4Apr.,2 0 2 2doi:10.11707/j.1001-7488.20220408收稿日期:2021-04-16;修回日期:2021-11-14。基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(CAFYBB2016QA015)。厉月桥为通讯作者。RAD-seq 技术研究鹅掌楸属种源遗传多样性和遗传结构潘文婷孙建军原勤勤张利利邓康桥厉月桥(中国林业科学研究院亚热带林业实验中心分宜 336600)摘要:【目的】揭示鹅掌楸属遗传结构和地理变异特点,为鹅掌楸属遗传资源的保存、利用及改良提供依据。【方法】以 9 个鹅掌楸种源 97 份样本和 4 个北美鹅掌楸种源 46 份样本为材料,采用 RAD-seq 测序鉴定各样本SNP 标记,计算观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、核苷酸多样性()和基因分化系数(Gst)等遗传统计量指标,分析鹅掌楸属种源遗传多样性和遗传结构。【结果】在 143 份鹅掌楸属样本中共鉴定出 4 454 个高质量的 SNP 标记;鹅掌楸种源之间存在较大的遗传分化以及中水平的基因流(Gst=0.241 9、Nm=0.805 1),北美鹅掌楸种源之间存在很大的的遗传分化以及低水平的基因流(Gst=0.388 60.25、Nm=0.397 0);通过结构分析将 13 个鹅掌楸属种源分为 3 个类群,其中 9 个中国的鹅掌楸种源被分为东部种源群(即类群 2)和西部种源群(即类群 1),类群 3 均为北美鹅掌楸,遗传多样性顺序为:类群 3类群 1类群 2。【结论】鹅掌楸属遗传结构的形成与其地理隔离和片段化分布有关,且存在由于小群体效应和片段化影响导致的濒危现象,本研究开发的 SNP 标记可为鹅掌楸属分子鉴定、种质创新及种质资源收集与保存提供参考。关键词:鹅掌楸属;RAD 测序;遗传多样性;遗传结构中图分类号:S722.3+4;S718.46文献标识码:A文章编号:1001-7488(2022)04-0074-08Analysis of Genetic Diversity and Structure in Different Provenances of Liriodendron by RAD-seq TechniquePan WentingSun JianjunYuan QinqinZhang LiliDeng KangqiaoLi Yueqiao(Subtropical Experimental Center,CAFFenyi 336600)Abstract:【Objective】This study aims to reveal the genetic structure and geographic variation characteristics of Liriodendron populations,in order to provide a basis for the conservation,utilization and improvement of genetic resources of Liriodendron.【Method】A total of 97 samples derived from 9 provenances of Liriodendron chinensis and 46 samples derived from 4 provenances of L.tulipifera were collected.The SNP markers of the samples were identified by RAD-Seq sequencing.The observed heterozygosity(Ho),expected heterozygosity(He),nucleotide diversity(),gene differential coefficient(Gst)and other genetic statistics were calculated to analyze the genetic diversity and genetic structure of Liriodendron provenances.【Result】A total of 4 454 high quality SNP markers were identified in the 143 samples of Liriodendron.There were Liriodendron maintained moderate genetic differentiation and medium level gene flow among provenances of L.chinensis(Gst=0.241 9,Nm=0.805 1).There were large genetic differentiation and low level gene flow among L.tulipifera provenances(Gst=0.388 60.25,Nm=0.397 0).The 13 Liriodendron provenances were divided into 3 subgroups by population structure analysis.Among them,9 provenances of L.chinensis were divided into eastern provenances(group 2)and western provenances(group 1),and the other provenances belonged to group 3 and they are all L.tulipifera.The order of genetic diversity was:group 3 group 1 group 2.【Conclusion】The formation of genetic structure of Liriodendron is related to its geographical isolation and fragmented distribution,and there are endangered phenomena caused by small population effect and fragmentation.The SNP markers developed in this study can provide a reference basis for molecular identification,germplasm innovation and collection and preservation of germplasm resources of Liriodendron.Key words:Liriodendron;RAD-seq;genetic diversity;genetic structure第 4 期潘文婷等:RAD-seq 技术研究鹅掌楸属种源遗传多样性和遗传结构木 兰 科(Magnoliaceace)鹅 掌 楸 属(Liriodendron)为落叶大乔木,叶大形似马褂,故又称之为“马褂木”,欧洲人称其为“郁金香树”,是珍贵用材和优良观赏树种。现仅存两个种,即北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)和鹅掌楸(Liriodendron chinense),为孑遗树种,前者生长于美国东部及加拿大南部的阔叶林中,从平原到山区呈连续分布,遗传资源十分丰富;后者大多零星分布于我国长江流域以南的亚热带中、低山区,常混生于常绿或落叶阔叶林中(郝日明等,1995),虽分布范围较大且遗传多样性良好,但因种群数量稀少,种群片段化严重,天然更新不良,处于濒危状态,已被列入我国二级珍稀濒危保护植物(王章荣,2005)。鹅掌楸属中的这两个种是典型的东亚-北美间断分布“种对”(Vicariad Species Pairs)(Parks et al.,1990),是植物群体遗传学和分子 系 统发育地理学的理想材料(李康琴,2013)。随分子标记研究方法的增多,对鹅掌楸分子育种研究也逐渐完善,王晓阳等(2011)利用 SSR 技术研究鹅掌楸苗期生长杂种优势;李康琴(2013)基于SSR 技术对鹅掌楸属进行群体遗传结构及分子系统地理学 研 究;罗 群 凤 等(2015)采 用 同 源 克 隆 和RACE 技术克隆北美鹅掌楸的查尔酮合成酶基因(LtCHS),并对其进行生物信息学及组织表达进行了分析;祁荔(2017)利用 AFLP 及 SSR 分子标记构建鹅掌楸遗传图谱及重要性状 QTL 初步定位。近年来基于全基因组酶切位点相关的简化基因组测序基础 上 发 展 出 来 了 二 代 测 序 技 术 RAD-seq(Restriction-site associated DNA sequencing),该技术由 Miller 等(2007)提出,主要利用酶切、序列捕获降低基因 组 复 杂度从而获得部分 基 因 组 序 列 信 息(Wang et al.,2017;Jrmy et al.,2020),作为一种快速有效的手段,实现大规模的分子标记开发,既节约成本又节省时间,已成功应用于 SNP 标记的开发、动植物重要经济性状的 QTL 定位、生物进化等研究领域(Feng et al.,2020;Li et al.,2020)。陆叶等(2019)利用 RRAD-seq 技术开展了鹅掌楸基因组 SNP 标记开发,最终获得 3 501 个候选 SNP 标记;Sheng 等(2021)利用 RAD-seq 技术分析了鹅掌楸Myb 基因家族的表征及其在非生物胁迫应答中的作用,可见 RAD-seq 技术能提供更多 SNP 标记,有效补充了鹅掌楸遗传信息较少这一问题,但有关鹅掌楸属群体遗传结构和遗传分化的研究较少。开展群体结构和遗传分化的研究能精准评估遗传多样性和制定科学有效的种质资源保护策略,李云飞等(2019)采用 RAD-seq 技术开发了 85 种杜鹃花属植物的高质量 SNP 位点,通过高通量测序探讨分类,在亚属水平的分类取得很好的效果。黄承玲等(2021)采 用 RAD-seq 技 术 对 34 种 杜 鹃 花 属(Rhododendron)植物进行分类,证实了 RAD-seq 技术在复杂植物类群的物种分类方面比传统分子标记具有明显优势。本研究利用 RAD-seq 测序技术,以9 个中国鹅掌楸和 4 个北美鹅掌楸种源为研究材料,通过高通量测序,对 13 个鹅掌楸属种源 143 份样本进行了遗传多样性、遗传变异、遗传分化以及群体基因交流等分析,揭示鹅掌楸属各种源亲缘关系,以期为鹅掌楸属分子鉴定、种质创新及种质资源收集与保存提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验材料共有 13 个鹅掌楸属种源,其中 9 个来自中国 7 个省,另外 4 个来自美国,相关种源地理信息详见表 1。所有种源种植在中国林业科学研究院亚热带林业实验中心年珠实验林场鹅掌楸种源试验林中。分别于 2016 年 10 月和 2017 年 5 月进行采样,每个种源随机采取 10 14 株树,每株树取 5 6片叶,共采集了 143 份鹅掌楸属样本,其中有 97 个样本采自 9 个中国鹅掌楸种源,还有 46 个样本采自4 个北美鹅掌楸种源。样本用自封袋装好并倒入硅胶干燥、保存。1.2基因组 DNA 的制备全部 143 份鹅掌楸属样本的基因组 DNA 采用改良的 CTAB 法(Liu et al.,2008)提取,用 1.0%琼脂糖凝胶检测 DNA 质量。1.3酶切建库利用 RAD-seq 技术对 143 份鹅掌楸属样本的基因组 DNA 进行简化测序。采用限制性内切酶 AvaII与 MspI 酶 切 组 合 对 全 基 因 组 DNA 完 全 酶 切(Peterson et al.,2012),(插入片段范围:500 600 bp,将酶切产物进行 5末端修复,同时对 5末端进行磷酸化修饰,3末端加 A,使之与接头 5端 T 互补,提高接头连接效率,阻止接头自连。然后连接测序接头,将连接产物锚定在 flowcell 上,进行桥式扩增。用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择,通过PCR 扩 增,增 大 文 库 量,建 好 的 文 库 用 Illumina HiSeq X10 进行测序。57林业科学58 卷表 1各参试种源地理信息及参试数量Tab.1Geographic information and sample number of 13 provenances in the experiment种源Provenance种源地Provenance region北纬Latitude东经Longitude海拔Elevation/m样品数Number of samplesXY四川叙永Sichuang Xuyong28.20N105.5E70090010EX湖北鄂西Hubei Exi30.30N109.0E1 1001 30011MN贵州陌南Guizhou Monan26.80N109.5E9501 15011LY湖南浏阳Hunan Liuyang28.05N113.9E1 0001 20011SZ湖南桑植Hunan Sangzhi29.15N110.2E1 1001 30011LS江西庐山Jiangxi Lushan29.53N116.0E1 0001 20010WYS江西武夷山Jiangxi Wuyishan27.92N117.8E9001 10010MSL密苏里州Missouri37.60N91.5W60080011LYS路易斯安纳州Louisiana31.00N93.6W010010BK北卡罗来纳州North Carolina35.13N80.1W1 0001 20012NK南卡罗来纳州South Carolina34.50N81.8W10030014YN云南勐腊Yunnan Mengla21.40N101.6E60080011DBS大别山舒城Dabieshan Shucheng31.13N118.2E1 3501 550111.4统计分析对原始数据进行识别、过滤、质量评估,再进行单样本测 序 数 据 的 RAD 标 记 开 发、样 本 群 体 的RAD 标记开发、多态性标记 SNPs 开发等,最后开展群体多样性分析,包括进化树构建及群体结构分析等。主 要 通 过 Stacks 软 件(http:creskolab.uoregon.edu/stacks/)(Catchen et al.,2013)进 行RAD 标记开发。基因组经酶切处理打断为多个小片段,每个片段相当于一个标记位点,同一位点的序列通过相似性聚类,形成一个 Stack。每个 Stack 中存在数条高深度片段,其余全为低深度片段。高深度片段即为潜在基因型,低深度片段可能由于测序错误导致。采 用Mega5.1软 件(http:www.atgc-montpellier.fr/phyml/)(Tamura et al.,2011)中 的Upgma 算法和 Neighbour-joining 分别构建 13 个种源的关系树和 143 份样本的进化树。通过 Admixture软件(Lexander et al.,2009)对 143 份样本的群体结构进行聚类分析,该软件运算速度快,创建 Plink(http:pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/)的输入文件,用 Plink 进行 SNP 过滤,将样品的分群数(K 值)设定为 1-6 进行聚类,根据 CV error 最小值确定分群数。使 用 POPGENE 1.32 软 件(http:www.ualberta.ca/fyeh/download.htm.)(Yeh et al.,2000)计算观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、核苷酸多样性()和基因分化系数(Gst)等主要遗传结构的度量参数。2结果与分析2.1RAD-seq 测序及质量评估本研究通过 RAD-seq 测序技术,完成 13 个鹅掌楸属种源的 143 份样本的测序,总碱基数为 396.95 Gb,样本平均获取的碱基数为 2.76 Gb;测得有效数据为 1 323.17 Mb,样本平均获取的有效数据为9.21 Mb;共开发 RAD 标签 2 611 618 个,样本的平均标签数为 141 222 个,平均测序深度为 25.02 x(表 2)。所 测 序 列 GC 含 量 较 低(平 均 值 为26.51%),Q30 数据较高(平均值为 95.07%),表明错误率低,测序结果可靠。通过对样本间进行多态性分析,共得到高质量的 SNP 位点 4 454 个。67第 4 期潘文婷等:RAD-seq 技术研究鹅掌楸属种源遗传多样性和遗传结构表 2RAD-seq 测序数据统计Tab.2Statistics of RAD-seq sequencing data of 13 provenances种源Provenance总碱基数Total nucleotides(Gb)有效数据Clean reads(Mb)RAD 标记数RAD tag测序深度Sequencing depth(x)XY1.775.90129 42016.29EX2.468.19140 08020.19MN4.2014.01155 03034.20LY1.946.46147 27017.77SZ1.414.70157 95013.70LS4.3714.57156 65035.74WYS2.719.02128 70025.34MSL3.8912.97136 12039.76LYS3.7512.50139 34034.95BK1.996.62140 02019.14NK3.1410.48128 72029.78YN2.157.16127 33019.47DBS2.167.20149 23018.97均值 Mean2.769.20142 13024.762.2种源遗传多样性统计对 13 个鹅掌楸属种源的遗传多样性相关参数进行统计(表 3),结果表明,Ho为 0.013 2 0.049 6,均值为 0.037 9;He为 0.022 2 0.059 7,均值为0.047 7;为 0.023 6 0.064 0,均值为 0.050 6。采用隶属函数法(彭松等,2014)对 Ho、He和 进行综合评价(表 4),其中遗传多样性排前三位的种源依次为 EX,NK 和 BK,DBS 种源的遗传多样性最低。表 3各种源遗传结构参数统计Tab.3Statistics of genetic structure in different provenances种源Provenance等位基因数Allele numberHoObserved heterozygosityHeExpected heterozygosityNucleotide diversityGstGene differential coefficientNmGene flowXY4 3340.035 20.059 70.064 00.211 20.933 8EX5 5730.049 60.058 10.061 70.196 81.020 3MN3 8340.039 50.047 20.049 90.243 00.778 8LY2 9340.036 40.049 90.053 00.237 80.801 3SZ4 2120.036 90.052 00.055 50.213 10.923 4LS8550.044 80.045 90.048 90.235 40.812 2WYS7580.038 90.044 80.047 30.234 90.814 4MSL1 1130.038 60.038 40.040 60.439 80.318 4LYS2 7260.043 80.055 10.058 80.385 50.398 5BK2 0170.044 20.058 10.061 60.367 90.429 5NK3 3090.047 10.058 80.061 60.361 50.441 6YN2 6040.013 20.029 90.031 60.280 20.642 2DBS1 2450.024 40.022 20.023 60.324 80.519 8均值Mean2 7320.037 90.047 70.050 60.287 10.679 6表 413 个鹅掌楸属种源遗传多样性各指标的隶属函数值Tab.4Subordinative function values of genetic diversity parameters among 13 provenances in Liriodendron参数parametersXYEXMNLYSZLSWYSMSLLYSBKNKYNDBSHo 得分 Ho score0.601.000.720.640.650.870.710.700.840.850.930.000.31He得分 He score1.000.960.670.740.790.630.600.430.880.960.980.210.00 得分 score1.000.940.650.730.790.630.590.420.870.940.940.200.00综合得分Comprehensive score2.602.902.042.102.242.131.901.552.592.752.850.400.3177林业科学58 卷2.3遗传结构分析对 13 个鹅掌楸属种源的 Gst和 Nm数据(表 3)进行分析,结果表明 Gst从 0.196 8 到 0.439 8,鹅掌楸种源之间存在较大的遗传分化(Gst=0.241 9)以及中等的基因流(Nm=0.805 1,其中种源 EX 的 Nm1),北美鹅掌楸种源之间存在很大的的遗传分化(Gst=0.388 6 0.25)以及低水平的基因流(Nm=0.397 0),表明北美鹅掌楸遗传变异主要存在于种源间。基于筛选的有效 SNP,通过 Mega5.1 软件中的Upgma 算法和 Neighbour-joining 分别构建 13 个种源的关系树(图 1)和 143 份样本的进化树(图 2),结果显示,13 个鹅掌楸属种源被分为 3 个类群,其中XY、YN、EX、SZ 和 MN 5 个种源为一个类群;LY、DBS、LS 和 WYS 4 个种源为一个类群;NK、LYS、MSL 和 BK 4 个种源为一个类群。图 2143 份样本的进化树Fig.2Neighbour-joining phylogram illustrating genetic relationships among 143 individuals每一个分枝代表一份种质材料,树枝长度代表两个物种间的进化距离,树分支上的数字代表该分支的支 持 的 百 分 数。Each branch represents one piece of germplasm,and the length of the branch represents the evolutionary distance between two species,the number on a branch of the tree represents the percentage of support for that branch.通过 Admixture 软件对 143 份样本的群体结构图 113 个种源的关系树Fig.1Relation tree of 13 provenances in Liriodendron进行聚类分析,假设样品的分群数(K 值)为 1 6,对应的 CV error 值分别为:0.465 4,0.178 6,0.142 1,0.153 1,0.163 2,0.168 9(图 3)。其群体结构最87第 4 期潘文婷等:RAD-seq 技术研究鹅掌楸属种源遗传多样性和遗传结构图 3分群数为 24 的聚类图Fig.3Bar plot of 2-4 clusters identified with adegenet R package左图图中每种颜色代表一个群体,每列代表一个样品的情况;图中展示了 143 个样品分群值从 24 的聚类情况。右图中为每个 K 值对应的 CV error 值,K 为 3 的时候最小。The picture left shows the clustering of 143 samples with cluster values from 2 to 4(each color represents a subgroup,Each column represents a sample).The figure on the right shows the CV error value corresponding to each K value(When K is 3,the CV error value is minimal).优分群数为 3,分群的结果与关系树和进化树分析所得结果基本一致。3讨论本研究通过 RAD-seq 测序技术,完成 13 个鹅掌楸属种源的 143 份样本的测序,平均测序深度为25.02,共获得总碱基数 396.95 Gb,平均每个样本的碱基数为 2.76 Gb,获得高质量 SNPs 标记 4 454个。比李云飞等(2019 年)获得的 3 501 个 SNP 标记多,这与本研究有 13 个种源的研究材料,而李云飞等(2019 年)为 2 个种源有关,但均比以往鹅掌楸的分子标记开发技术获得的候选 SNPs 数量有显著提高。这些标记进一步增加了鹅掌楸属的基因组资源量,可更准确地界定群体分类,为鹅掌楸属资源的遗传保存、育种及改良应用提供依据(李云飞等,2019;黄承玲等,2021)。以获得的高质量 SNP 位点为基础,进一步分析13 个鹅掌楸属遗传多样性和遗传结构。遗传多样性排前三位的种源依次为 EX,NK 和 BK,DBS 种源的遗传多样性最低。但总体与报道的鹅掌楸遗传多样性数值(李康琴,2013;赵亚琦等,2014)相比较低,可能是由于遗传多样性的估算受样本数量、采样策略及基因分型数据等因素的影响,本研究样本数量较少,且为种源试验林内采样,因此遗传多样性较低。对 13 个鹅掌楸属种源的 Gst和 Nm数据进行分析,结果表明 Gst从 0.196 8 到 0.439 8,鹅掌楸种源之间存在较大的遗传分化以及中等的基因流(Gst=0.241 9、Nm=0.805 1,其中种源 EX 的 Nm1),北美鹅掌楸种源之间存在很大的的遗传分化以及低水平的基因流(Gst=0.388 60.25、Nm=0.397 0),表明鹅掌楸属遗传分化变异主要存在于种源间;EX 种源的 Nm值大于 1,表明基因流可以防止由遗传漂变引起的群体间的遗传分化,但各种源间 Nm均值只有 0.679 6;且多数种源 Ho小于期望杂合度 He。群体间的高度分化的根源在于由生境片段化而引起的遗传漂变和群体间低水平的基因流(Zaouali et al.,2012),可见鹅掌楸属存在由小群体效应和片段化影响导致的濒危现象,该结论与李康琴(2013)的研究的结果一致。通过对 13 个鹅掌楸属种源的 143 份样本进行聚类分析和群体结构分析,可将 13 个鹅掌楸属种源分为 3 个类群,其中 XY、YN、EX、SZ 和 MN 5 个种源为类群 1;LY、DBS、LS 和 WYS 4 个种源为类群2;NK、LYS、MSL 和 BK 4 个种源为类群 3。经过分析可见类群 1 和类群 2 分别处在中国西部和东部,该结论进一步验证了朱晓琴等(1995)和 李康琴(2013)的研究结果,可见鹅掌楸属遗传结构的形成与其地理隔离和片段化分布有关。中国东部种源群(类群 2)较中国西部种源群(类群 1)遗传多样性高(Ho:0.036 10.034 9),但均低于北美鹅掌楸(类群 3)遗传多样性,该结论与李康琴(2013)的结论一致。进化树和聚类图均显示 3 个类群间出现了少数的个体混杂现象,表明群体间有基因交流的现象,因此,利用这些材料进行杂交育种时,既要考虑其亲缘关系也要注意他们的遗传结构。4结论采用 RAD-seq 技术对鹅掌楸属 13 个种源 143份样本进行测序,获得了高质量 SNP 位点,进而分析鹅掌楸属遗传多样性、群体结构分析及进化树的构建,鹅掌楸属 13 个种源被分为 3 个类群,其中北美鹅掌楸和鹅掌楸可显著区分、中国东部鹅掌楸和西部鹅掌楸的差异也很显著。本研究结果表明高效的 RAD-seq 技术获得的大量 SNP 位点可应用于鹅掌楸属物种的区分,进一步证实了鹅掌楸属遗传结构的形成与其地理隔离和片段化分布有关,且存在由于小群体效应和片段化影响导致的濒危现象;同97林业科学58 卷时这些 SNP 标记可进一步用于鹅掌楸属 QTL 定位、遗传连锁图谱、分子辅助育种等研究,进而为鹅掌楸属的遗传演化研究提供理论基础,为今后鹅掌楸属种质创新及种质资源收集与保存提供参考依据。参考文献郝日明,贺善安,汤诗杰,等.1995.鹅掌楸在中国的自然分布及其特点.植物资源与环境,4(1):1-6.(Hao R M,He S A,Tang S J,et al.1995.Geographical distribution of Liriodendron chinense in China and its significance.Plant Resources and Environment,4(1):1-6.in Chinese)黄承玲,姚刚,田晓玲,等.2021.基于 RAD 高通量测序的贵州百里杜鹃保护区杜鹃花属分类.林业科学,57(2):72-81.(Huang C L,Yao G,Tian X L,et al.2021.Phylogenomic analysis of rhododendron species in Guizhou Baili rhododendron reserve based on RAD sequencing.Scientia Silvae Sinicae,57(2):72-81.in Chinese)李康琴.2013.鹅掌楸属群体遗传结构及分子系统地理学研究.南京:南京林业大学.(Li K Q.2013.Studies 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