专题复习PCR技术省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

PCRPCR技术技术高考专题复习高考专题复习第1页多聚酶链式反应多聚酶链式反应（Polymerase Chain Polymerase Chain ReactionReaction），是一个体外快），是一个体外快速扩增速扩增DNADNA片段技术。片段技术。19881988年美国穆里斯年美国穆里斯（K.MullisK.Mullis）等人）等人创造，荣创造，荣获获19931993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。PCRPCR第2页【基础知识】【基础知识】一、一、PCRPCR原理：原理：DNADNA复制：复制：半保留复制；半保留复制；第3页【基础知识】【基础知识】一、一、PCRPCR原理：原理：DNADNA复制：复制：半保留复制；半保留复制；v需要提供合成模板；需要提供合成模板；v不能起始新不能起始新DNADNA链，必须要有引物提供链，必须要有引物提供3-OH3-OH；v合成方向都是合成方向都是5353。DNADNA聚合酶聚合酶第4页【基础知识】【基础知识】一、一、PCRPCR原理：原理：DNADNA复制：复制：半保留复制；半保留复制；DNADNA热变性原理。热变性原理。TaqTaq DNADNA聚合酶聚合酶v耐高温。耐高温。第5页【基础知识】【基础知识】二、二、PCRPCR条件：条件：胞内胞内DNADNA复制与复制与PCRPCR技术比较：技术比较：胞内胞内DNADNA复制复制PCRPCR解旋解旋解旋酶，边解旋边复制解旋酶，边解旋边复制酶酶解旋酶解旋酶/DNA/DNA聚合酶聚合酶/DNA/DNA连接酶连接酶/引物酶引物酶模板模板DNADNA母链母链引物引物RNARNA能量能量+原料原料dNTPdNTP温度温度最适温度最适温度缓冲液缓冲液MgMg2+2+,缓冲对缓冲对子链合成子链合成半不连续复制半不连续复制变性变性Taq Taq DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA母链母链dNTPdNTP3 3个温度个温度MgMg2+2+,缓冲对缓冲对连续复制连续复制DNADNA第6页【基础知识】【基础知识】二、二、PCRPCR条件：条件：引物：引物：v利用软件设计。利用软件设计。v引物设计标准：引物设计标准：决定决定PCRPCR扩增产物特异性和长度。扩增产物特异性和长度。1.1.引物长度：引物长度：通常为通常为202030bp30bp，尽可能，尽可能降低引物与非降低引物与非扩增区同源性；扩增区同源性；2.2.引物内部不能存在部分互补序列；引物内部不能存在部分互补序列；3.3.两个引物之间不能存在部分互补序列；两个引物之间不能存在部分互补序列；4.4.引物引物55端能够修饰，但端能够修饰，但33端不能够修饰：端不能够修饰：如探针标识。如探针标识。第7页例题例题 1 1【年安徽】家蚕细胞含有高效表示外源基因能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，能够提取干扰素用于制药。采取PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系主要成份应该包含：扩增缓冲液（含Mg2+）、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、和 。对干扰素基因特异对干扰素基因特异DNADNA引物对引物对TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶第8页例题例题 2 2【年江苏】请回答基因工程方面相关问题：（1）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（以下列图），请分别说明理由。第一组：第一组：；第二组：第二组：。引物引物和引物和引物局部发生碱基互补配对而失效局部发生碱基互补配对而失效引物引物本身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效本身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效（2 2）PCRPCR反应体系中含有热稳定反应体系中含有热稳定DNADNA聚合酶，下面表示式不能正确聚合酶，下面表示式不能正确反应反应DNADNA聚合酶功效，这是因为聚合酶功效，这是因为 。DNA DNA聚合酶只能将单个脱氧核聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链苷酸连续结合到双链DNADNA片段引物链上片段引物链上 第9页【基础知识】【基础知识】二、二、PCRPCR条件：条件：温度：温度：v70707575：v90909595：v55556060：变性；变性；复性；复性；延伸。延伸。【注意】【注意】详细温度与详细温度与DNADNA母链母链及引物中及引物中G G、C C含量相关。含量相关。第10页例题例题 3 3【年江苏】回答以下问题。（1）在采取常规PCR方法扩增目标基因过程中，使用DNA聚合酶不一样于普通生物体内DNA聚合酶，其最主要特点是 。（2）PCR过程中退火（复性）温度必须依据引物碱基数量和种类来设定。表1为依据模板设计两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采取较高退火温度？。耐高温耐高温 引物对引物对B B 第11页【基础知识】【基础知识】三、三、PCRPCR过程：过程：预变性；预变性；复性；复性；延伸；延伸；循环。循环。变性；变性；第12页【年江苏】利用PCR技术扩增目标基因，其原理与细胞内DNA复制类似（以下列图所表示）。图中引物中为单链DNA片段，它是子链合成延伸基础。（1）从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物ADNA片段所占百分比为 。（2）在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长DNA片段。15/1615/16三三例题例题 4 4第13页【试验操作】【试验操作】一、试验仪器：一、试验仪器：第14页二、设置对照：二、设置对照：【试验操作】【试验操作】三、程序设计：三、程序设计：防止外源防止外源DNADNA污染。污染。第15页【试验操作】【试验操作】微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；必须进行高压灭菌；微量离心管在每吸收一个试剂都必须更换枪头；微量离心管在每吸收一个试剂都必须更换枪头；全部成份加入离心管后，盖严盖子，用手指轻轻弹全部成份加入离心管后，盖严盖子，用手指轻轻弹击管侧壁，离心击管侧壁，离心10s10s，使反应液集中在离心管底部，使反应液集中在离心管底部，再放入再放入PCRPCR仪中进行反应。仪中进行反应。四、操作提醒：四、操作提醒：第16页【实际应用】【实际应用】一、遗传疾病诊疗：一、遗传疾病诊疗：二、刑侦破案；二、刑侦破案；三、古生物学；三、古生物学；四、基因克隆：四、基因克隆：五、五、DNADNA序列测定。序列测定。v基因诊疗；基因诊疗；第17页