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基于间接波前整形的近红外二区荧光共聚焦成像研究.pdf
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1、文章编号2097-1842(2024)01-0150-10基于间接波前整形的近红外二区荧光共聚焦成像研究谭天1,2,史天悦2,吴长锋2,彭洪尚1*(1.中央民族大学理学院光子系统工程软件教育部工程研究中心,北京100081;2.南方科技大学生物医学工程系,广东深圳518055)摘要:生物组织散射引起的光学像差限制了光学系统的成像性能。本文研究了基于间接波前整形的近红外二区荧光共聚焦成像技术。首先,制备了高效率近红外二区荧光探针,降低该波段生物组织的散射有助于实现高对比度的活体组织成像。其次,研究了基于间接波前测量的自适应光学方法,将间接波前整形技术应用于激光扫描共聚焦显微系统中,以实现对生物组
2、织引起的光学像差的测量与补偿,获得生物组织的高信噪比成像。最后,对基于间接波前整形的近红外二区荧光共聚焦成像系统开展了相关实验。实验结果表明,本系统对空气平板、散射介质和小鼠颅骨等产生的像差具有良好的补偿效果,最终信号强度较初始值分别提升了 1.47、1.95 和 2.85 倍,显著提升了最终的成像质量。关键词:间接波前整形;近红外二区成像;共聚焦成像;活体实验中图分类号:O439文献标志码:Adoi:10.37188/CO.2023-0070NIR-IIfluorescenceconfocalimagingbasedonindirectwavefrontshapingTANTian1,2,S
3、HITian-yue2,WUChang-feng2,PENGHong-shang1*(1.Engineering Research Center of Photonic Design Software Ministry of Education,College of Science,Minzu University of China,Beijing 100081,China;2.Department of Biomedical Engineering,Southern University of Science and Technology,Shenzhen 518055,China)*Cor
4、responding author,E-mail:Abstract:Opticalaberrationscausedbythescatteringofbiologicaltissueslimittheimagingperformanceofopticalsystems.Anear-infraredIIfluorescenceconfocalimagingtechniquebasedonindirectwavefrontshapingwasinvestigated.First,wesynthesizedahighlyefficientnear-infraredIIrangefluorescent
5、probe,收稿日期:2023-04-18;修订日期:2023-05-10基金项目:国家自然科学基金(No.62175266,No.62235007,No.22204070);深圳市科技计划项目(No.KQTD20170810111314625,No.JCYJ20210324115807021,No.SGDX20211123114002003);深圳湾实验室开放课题(No.SZBL2021080601002);广东省先进生物材料重点实验室(No.2022B1212010003)Supported by the National Natural Science Foundation of Chi
6、na(No.62175266,No.62235007,No.22204070);theShenzhenScienceandTechnologyProgram(No.KQTD20170810111314625,No.JCYJ20210324115807021,No.SGDX20211123114002003);theShenzhenBayLaboratory(No.SZBL2021080601002);GuangdongProvincialKeyLaboratoryofAdvancedBiomaterials(No.2022B1212010003)第17卷第1期中国光学(中英文)Vol.17No
7、.12024 年 1 月ChineseOpticsJan.2024wherereducingthescatteringofbiologicaltissuecanrealizebiopsyimagingwithhigh-contrast.Second,weinvestigatedtheadaptiveopticalmethodbasedonindirectwavefrontmeasurement.Theindirectwavefrontshapingtechnologywasappliedtothelaserscanningconfocalsystem,enablingthemeasuremen
8、tandcom-pensationofopticalaberrationscausedbybiologicaltissues,andobtainingimagingofbiologicaltissueswithahighsignal-to-noiseratio.Finally,near-infraredIIfluorescenceconfocalimagingsystembasedonindirectwavefrontshapingwasdeployedandrelevantexperimentswereconducted.Theexperimentalresultsindic-atethat
9、thesystemeffectivelycompensatesfortheaberrationsinducedbyairplates,scatteringmediaandmouseskull,andincreasesthefinalsignalintensityby1.47,1.95and2.85times,respectively.Asaresult,thefinalimagingqualityissignificantlyenhanced.Keywords:Indirectwavefrontshaping;near-infrared-IIimaging;confocalimaging;in
10、vivoexperiments1引言高分辨率的光学成像技术一直是推动生物学发展的主要手段,在生物分子解构1、光遗传2和细胞形态学3等方面发挥着不可替代的作用。然而,生物组织的折射率分布不均匀,组织的散射会引起严重的光学像差,使得照明光无法高保真度地聚焦,从而限制了组织成像的深度和信噪比。随着成像深度的增加,生物组织产生的光学像差阶数也逐渐增加4,以至于照明光被多次散射而完全丢失其光场信息。这导致实现生物组织深处的非侵入性的高分辨显微成像变得愈发困难。因此,它也成为光学研究领域公认的难点之一5。生物组织对光的影响主要表现为散射和吸收,两者均与光的波长密切相关。研究表明在生物组织中存在具有较低散射
11、系数和吸收系数的“近红外窗口”,可以缓解生物组织对于入射光线的影响6。虽然,目前对于近红外一区荧光材料的研究逐渐完善7,但仍难以满足人们对成像深度的需求。近年来,由于近红外二区荧光成像具有更深的组织穿透率,故其作为一种新兴技术逐渐在成像中得到广泛应用8。在近红外二区窗口(NIR-II,10001700nm),Dai 课题组开发了小动物成像系统9-10和光片显微系统11。由于抑制了激发和发射光在生物组织中的散射,生成的图像明显比传统可见光和近红外一区窗口的图像更清晰。当前,近红外二区成像面临的主要问题是性能优异、生物相容性好的荧光探针比较匮乏12-13。因此,开发高效的 NIR-II 荧光探针是
12、活体荧光成像的热点之一。自适应光学(AdaptiveOptics,AO)正在被引入至成像系统中,以校正成像过程中产生的各类光学像差14。AO 方法是一种光电仪器和计算方法相结合的方法,由 3 个主要组件组成:测量像差的传感器,补偿像差的校正器15-17以及根据传感器测量值计算校正器所需信号的控制器。光学像差可以使用专用波前传感器进行直接测量,也可以从图像中间接确定。人们将这两种方法分别称为“直接波前测量 AO”18-19和“间接波前测量AO”20-21。在生物成像领域,相比于直接波前测量 AO,间接波前测量 AO 不需要依赖波前传感器和在目标区域内置“引导星”标记,可以显著降低实验的复杂度和对
13、于目标的侵入性。因为没有专用的波前传感器,在确定存在的像差大小和所需的校正方面,间接方法明显慢于基于传感器的方法。但是,由于显微镜和生物组织产生的像差能够相对静态地持续数小时之久22,故间接方法在生物显微成像领域也得到了广泛的应用。与非线性荧光相结合,Cui 小组23,24和 Judkewitz 小组25分别提出了新的间接波前测量办法。IMPAC23和 F-SHARP25,各自实现了小鼠大脑中达 400m深度的双光子成像。上述工作引发了广泛关注,但这两个工作并不能推广到头骨比较厚的应用场景26。如何进一步抑制生物组织的散射,提高高分辨率系统在生物组织内的成像深度仍有待于人们探索。本文制备了生物
14、相容性好、荧光亮度高的近红外二区荧光探针,在 808nm 激光激发下,发射波长覆盖 9901300nm,可以有效地抑制生物组织的散射对激发光和荧光信号的影响。进一步将第1期谭天,等:基于间接波前整形的近红外二区荧光共聚焦成像研究151基于间接波前测量的自适应光学方法与激光扫描共聚焦系统相融合,以校正生物组织产生的光学像差,提高穿透组织成像的分辨率和对比度。比较了两种常见的用于间接波前测量的控制算法,“遗传算法(GeneticAlgorithm,GA)”27和“动态自适应散射补偿全息术(DynamicAdaptiveScat-teringcompensationHolography,DASH)”
15、28。实验表明,虽然 DASH 算法被用于双光子成像的像差校正时,具有比 GA 算法更快的收敛速度和更高的信号提升能力,但在线性荧光成像中 GA 算法的校正效果却优于 DASH 算法。本文开展了一系列的仿体和活体实验,使用间接波前测量校正不同像差后,荧光信号强度提升为校正前的 1.47、1.95 和 2.85 倍,提升了系统的分辨率与对比度。本研究将近红外二区荧光探针与自适应光学像差补偿技术相结合,为深层生物组织内高分辨成像提供了新路径。2材料与方法2.1近红外二区荧光材料在可见光和传统的近红外一区窗口(700900nm),生物组织具有很强的散射,在近红外二区窗口(10001700nm),光学
16、散射显著降低。考虑到半导体聚合物具有良好的生物相容性和较高的量子效率(3%)29,本文选择其作为荧光探针材料,如图 1 所示。荧光探针在 700900nm 处有很强的吸收,在 990nm 处和 1118nm 处具有两个发射峰。因此,在 808nm 激光的激发下,可以实现近红外二区发射,从而显著降低生物组织对于激发光和荧光信号的散射。2.2荧光微珠的制备将直径为 100nm 的聚苯乙烯(PS)微球稀释到 0.5wt%的水溶液中,利用超声仪使其充分分散后用 0.22m 的滤头过滤。调配水和四氢呋喃(THF)体积比满足 51,向 PS 微球中快速注入1mg/L 的半导体聚合物 THF 溶液并涡旋 1
17、0s,之后搅拌 6h,以保证荧光探针的装载。将荧光微珠在 15000g 下离心 30min 后倒掉上清液并加水超声,重复清洗 1 次后制得的荧光微珠样本用于成像实验。2.3电纺丝样本制备电纺丝由于具有复杂的三维结构以及易于负载荧光材料的特性,可以模拟生物复杂的血管组织成像。使用 1mg/L 的半导体聚合物 THF 溶液将电纺丝浸透后在黑暗通风环境中晾干,之后用速干胶和玻片进行封装以制得由半导体聚合物标记的电纺丝样本。电纺丝样本中典型电纺丝的直径在 8m 左右。2.4散射模型的制备将 0.2g 的琼脂糖与 1.7mL 纯水混合后在90C 下恒温搅拌,充分溶解后加入 0.1mL 全脂纯牛奶并继续加
18、热,待混合均匀后取出静置凝固以制得具有一定散射系数的琼脂散射模型。2.5活体小鼠样本制备对 3 个月大的 C57 小鼠使用异氟烷气体进行麻醉后用电动理发剪和脱毛膏取出头部的毛发。通过尾静脉注射 100L、浓度为 200g/L 的半导体聚合物溶液并通过腹腔注射 10%的水合氯醛溶液以保证长时间麻醉。充分麻醉后使用手术剪剪去头皮,并用 3%的过氧化氢溶液清理骨外膜防止其对实验造成影响,最后使用生理盐水清洗创口。2.6系统光路设计设计的共聚焦成像系统如图 2(彩图见期刊电子版)所示,808nm 近红外连续激光器(DL808-400,CrystaLaser,USA)发射的波长为 808nm 的近红外光
19、作为激发光。发出的激光首先经过一个偏振片和 4f 扩束系统变为偏振光且光斑半径扩大为初始的 8.3 倍,以更方便液晶空间光调制器(SpatialLightModulator,SLM)对入射光束进行调制。随后扩束的激光光束经过一反射镜反射后以特定的角度入射到 SLM(PLUTO-2.1-NIR-135,holoeye,Germany)上。入射光经过 SLM 调制后通过一个 4f 收束系统使得光斑半径缩为扩束后1.00.8AbsPL0.60.40.20300600900Wavelength/nm1 2001 500Absorbance/(a.u.)Photoluminescence/(a.u.)图
20、1半导体聚合物荧光探针的吸收与发射光谱Fig.1Absorptionand emission spectra of the semicon-ductorpolymerfluorescentprobes152中国光学(中英文)第17卷的 0.42 倍。之后入射光先后经过二向色镜(Di-chroicmirror,DM)、扫描振镜(Galvoscanner,GS)(6210H,CambridgeTechnology,USA)、扫描透镜(Scanlens)(SL50-3P,Thorlab,USA)、管镜(Tubelens)(TTL200MP,Thorlab,USA)、反射镜和显微物镜(XLPlanN2
21、5X,Olympus,Japan)聚焦于样本上。通过扫描振镜、扫描透镜和管镜组成的中继光路可以实现聚焦光斑在样本平面内的扫描,最大扫描视场为 1320m1320m。样本激发出的荧光信号通过物镜、反射镜、管镜、扫描透镜、扫描振镜和二向色镜后由一焦距为 125mm 的凸透镜聚焦于光电倍增管(photomultipliertube,PMT)上,PMT 前放置一直径为 75m 的小孔以滤除目标激发区域以外的杂散光。在光学上,SLM 与样本表面的散射介质共轭,通过在 SLM上叠加一定的相位全息图,以对散射介质产生的像差进行补偿,从而缓解因散射介质导致的入射光不聚焦的问题。Laser808 nmPolar
22、izerSLMPMTObjectiveSampleExcitation lightSignal light7 2f=15 mmf=60 mmf=25 mmf=125 mmMirrorMirrorGalvo scannerScanlensDichroicmirrorTubelensf=125 mmf=50 mmf=200 mm图2基于间接波前测量的近红外激光共聚焦扫描显微系统Fig.2Near-infraredlaserscanningconfocalmicroscopebasedonindirectwavefrontsensing本文实验均采用 808nm连续激光对样本进行激发,使用长通滤光片
23、和PMT收集波长大于980nm的近红外荧光信号后重建图像。相比于目前常用的双光子、多光子成像采用的 500700nm 左右的信号光,本系统采用近红外一区激发、近红外二区发射的单光子成像方式具有更好的穿透组织的能力,可以有效提升未校正时的信号强度,为波前整形提供良好的前置条件。2.7基于间接波前测量的光学像差补偿方法在穿透散射介质的共聚焦成像中,由于散射介质对于入射光的散射作用,会使聚焦光斑的质量下降,并且随着深度的增加,这种影响会愈加显著,从而降低图像的对比度并影响成像的分辨率。对此,研究人员提出了直接测量像差波前并在反演后使用 SLM 对其进行校正的直接波前传感的方法18-19。但是该方法不
24、仅需要引导星等来标记从所需成像点发出的光,还会显著增加系统复杂度。基于间接波前传感的方法不需要波前传感器和引导星,其原理如图 3 所示。在经过一轮完整的成像流程后,探测器将捕获到的荧光信号传递至计算机,经过特定的算法处理后对 SLM 的相位校正作出控制并进行第二轮成像,再一次接受从传感器捕获的荧光信号。经过一系列的成像并对成像效果使用评价函数(CostFunction,CF)进行测量,计算机最终会找到可靠的校正模式。反馈控制激光器SLM成像系统探测器PC信号采集图3控制 SLM 的反馈系统Fig.3FeedbacksystemforcontrollingSLM当聚焦光斑质量提升时,成像荧光强度
25、会显著提升,同时因为更小的光斑会导致成像的展宽缩减,这会使得成像的整体锐度提升。所以本文选取了锐度函数作为对整体成像质量的评判标准,具体如下:cost function=n1f/n,第1期谭天,等:基于间接波前整形的近红外二区荧光共聚焦成像研究153其中:n 为成像图中采样点的个数,f 为由采样点坐标及其荧光强度建立的曲面函数。遗传算法(GeneticAlgorithm,GA)是一种用于间接波前测量的经典方法27。在迭代过程中使用评价函数对不同的相位矩阵调制下的成像图进行分析,选取评价函数较高的相位矩阵作为亲代,对其加权平均后生成子代,最终得到可以很好校正像差波前的校正模式。该算法已用于波前整
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