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基于生物信息学预测银屑病免疫诊疗基因.pdf
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1、432024JOURNALMEDICINEANDBIOLOGY2024年Vol.45No.1之之第45卷第1期杂志中国高原医与生物基于生物信息学预测银屑病免疫诊疗基因王岩岩,刘斌,王永*(青海大学附属医院,青海西宁810001)摘要目的基于生物信息学预测银屑病免疫诊疗基因。方法从基因表达综合公共数据库(GeneExpressionOmnibus,CEO)下载三个银屑病基因表达谱数据集,分析其基因表达情况。针对与银屑病相关的差异表达基因进行功能富集分析,并构建加权基因共表达网络(WGCNA)。通过绘制ROC曲线比较曲线下面积来评估预测基因的诊断价值。此外,我们还使用ssGSEA法来评估银屑病与免
2、疫细胞浸润水平的关系。结果发现了两个靶基因(ANKRD18A和ANKRD33B)ROC曲线分析提示,这两个基因可能在银屑病的发病机制中起重要作用。经过进一步的基因相关性分析和免疫浸润分析显示,这两个基因可能是诊疗银屑病的重要基因。结论ANKRD18A、ANKRD33B可作为诊疗银屑病的潜在基因关键词银病;ANKRD18A;A NK RD 33B;免疫;浸润中图分类号号R392.12文献标志码ADOI10.13452/ki.jqmc.2024.01.006Prediction of immune diagnosis and treatment genes of psoriasisbasedonb
3、ioinformaticsWANGYanyan,LIU Bin,WANG Yong(Affiliated Hospital of Qinghai University,Xining 810001,China)Abstract Objective To predict the immune diagnosis and treatment genes of psoriasis based on bioinformat-ics.Methods Three datasets of psoriasis gene expression profiles were downloaded from the G
4、ene Expression Om-nibus(GEO)to analyze their gene expression.Functional enrichment analysis was performed on differentially ex-pressed genes related to psoriasis,and a weighted gene co-expression network(WGCNA)was constructed.The di-agnostic value of the predicted genes was evaluated by plotting ROC
5、 curves to compare the areas under the curves.In addition,the ssGSEA method was used to evaluate the relationship between psoriasis and immune cell infiltra-tion levels.Results Two target genes(ANKRD18A and ANKRD33B)were discovered.ROC curve analysis suggest-ed that these two genes may play an impor
6、tant role in the pathogenesis of psoriasis.Further gene correlation analy-sis and immune infiltration analysis revealed that these two genes may be important genes for the diagnosis andtreatment of psoriasis.Conclusion ANKRD18A and ANKRD33B can be used as potential genes for the diagnosisandtreatmen
7、t of psoriasis.Keywordspsoriasis;ANKRD18A;ANKRD33B;immunity;infiltration收稿日期:2 0 2 3-0 3-16修回日期:2 0 2 3-0 6-0 4*:通信作者,主任医师,硕士生导师,318 王岩岩(1995一),女,汉族,河南籍,在读硕士研究生44银屑病(psoriasis)的诊疗在免疫细胞学研究上取得了突破,是学科的发展方向。目前该研究的关注热点是如何准确预测银屑病免疫诊疗基因。本研究应用生物信息学方法开展相关研究。1研究方法1.1测序方法从基因表达综合公共数据库(GeneExpressionOmnibus,GEO)
8、下载了三个银屑病基因表达谱数据集(GSE166388、G SE42 6 32 和GSE50790),分别采用CPL570、G PL13497、G PL57 0 测序平台(表1),对14个银屑病患者皮肤组织(P)和14个正常人的皮肤组织(C进行测序1.2分析方法本研究使用数据分析工具R软件Studio包2 做数据分析,利用limma包3研究基因的差异表达情况。通过R软件ggord包4绘制标本归一化箱式图、PCA图和火山图,以及利用R软件pheatmap包5绘制热图。为校正不同平台数据集的批次效应,我们使用R软件sva包进行了处理,最终将三个分析数据集整合为一个包含2 8 个样本和17 113个基
9、因的标准化基因表达矩阵;为判断不同批次数据集的批次效应是否被消除,我们使用R软件facto-extra包7|进行了主成分分析(Principal ComponentAnalysis,PCA),并对数据集中的P组和C组间的表达差异基因取交集,获得与银屑病相关的差异表达基因(这些差异表达基因在银屑病的发病机制中起重要作用)。表1平台信息表Table 1Platform information tableGEO数据集平台P组(n)C组(n)GSE166388GPL57044GSE42632CPL1349766GSE50790GPL570441.2.1差异表达基因分析法使用R软件中的limma包对合并
10、数据集得到的9 40 个基因进行了差异表达分析(在P组与C组间),根据校正后的显著性水平(P)和差异倍数(FC),我们设定P1为过滤标准,筛选出P组与C组之间的差异基因。通过R软件中的ggord包绘制标本归一化箱式图、火山图和PCA图,并使用pheatmap包绘制热图。1.2.2银屑病共表达模块基因的筛选及银屑病靶基因鉴定法WGCNA(We i g h t e d G e n e Co-Ex p r e s s i o n Ne t-workAnalysis)是一种适用于分析复杂样本的加权基因共表达网络方法8。它被广泛用于分析高通量测序数据中具有协同表达特征的基因模块,并探索这些模块特征基因与
11、特定临床表型之间的关系,从而识别和解读具有高度相关性的共表达模式基因。进行相关性分析时,通常需要计算两个基因之间的相关性系数(Person Co-efficient),并设定一个阈值来确定两个基因是否具有相关性,如设定相关性系数的阈值为0.8,并认定相关性系数达到0.8 时才认为两个基因之间具有相关性。然而在实际应用中,相关性系数为0.8的两个基因与相关性系数为0.7 9 的两个基因不一定存在显著差异。应用WGCNA可解决上述问题。目前WCCNA已广泛应用于疾病与基因关联分析研究,在不同阶段通过WCCNA对不同的基因网络进行模块构建和划分。首先,根据基因之间相互表达关系对样本进行聚类分析,通过
12、设定合理的剪切高度来去除异常的离群样本,减少对精确共表达网络的影响;其次,基于基因的加权相关性系数计算任意两个基因45之间的相关性并对基因的共表达模式进行分类;第三,通过动态树剪切聚类分析,将具有相同表达模式且高度相关的基因分组到同一个基因模块中。1.2.3基因本体论(Gene ontology,GO)9)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析10 法为了揭示目标基因的生物学功能,使用GO和KEGG富集分析法。GO是基于大数据和生物信息发展而来的一种功能注释分析方法,通过对目标基因进行功能注释,揭示其在分子功能(Mo-lecular
13、Function,M F)、生物学过程(Biological Pro-cess,BP)和细胞组分(Cellular Component,CC)三方面的作用,进而了解目标基因的生物学功能。KEGG富集分析库是一个包含基因组、生物通路等信息的实用数据库,它可以揭示目标基因在不同信号通路中的作用,并提供对这些通路的详细信息。本研究使用RStudio软件clusterProfiler包I进行GO、K EG G 分析,以探索银屑病特征基因在不同组别中可能参与的主要生物学过程和相关信号通路1.2.4靶基因选择与验证法为了找出银屑病的靶基因,本研究使用了两种机器学习算法。首先,使用R软件caret包12 进
14、行基于支持向量机的递归特征消除算法(SupportVectorMachine-Recursive Feature Elimination,SVM-RFE)SVM-RFE是基于SVM模型的特征选择方法,它通过递归地去除不重要的特征来选择最优的特征子集。该算法通过训练SVM模型并计算每个特征的权重,确定并去除这些不重要的特征,然后继续训练新的SVM模型,直到达到预设的特征数目13。其次,使用R软件glmnet包14进行最小绝对值收缩和算子算法(Least Absolute Shrinkage and Selection Op-erator,LASSO)选择。LASSO是一种线性回归的正则化方法,用
15、于计算和选择线性模型,并保留有价值的变量,从而实现选择靶基因的目的。本研究使用LASSO、SVM-RFE算法找出靶基因。1.2.5靶基因 GSEA(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)分析法为了更好地理解靶基因在银屑病中的作用,使用R软件clusterProfiler包进行基因集富集分析15。GSEA是一种常用的生物信息学方法,通过分析预定义基因集中的基因是否在P、C组中呈现明显的一致性差异,从而研究靶基因在一些信号通路中的富集情况。1.2.6靶基因的接受者操作特性曲线(Receiver Op-erating Characteristic,ROC)分析法ROC分
16、析方法简单直观,将真阳性率和假阳性率以图示的方式直接判断数据分析结果的可靠性。我们使用R软件pROC包16,分别绘制ANKRD18A、A NK RD 33B靶基因的ROC曲线,并计算曲线下面积(Area UnderROC Curve,A U C),可以准确评估靶基因的诊断价值1.2.7免疫浸润及相关性分析法单样本基因富集分析(Single-sampleGene SetEnrichmentAnalysis,s s G SEA)是对GSEA方法的扩展,用于评估输人样本中的基因集的富集程度17。为了了解银屑病组织和正常组织之间免疫细胞及相关通路的浸润程度,使用R软件gsva包计算其相关分数,并根据P
17、值判断其免疫浸润程度。使用R软件corrplot包计算靶基因与免疫细胞的相关性,根据P值判断其免疫相关性的显著性(*:P0.05,*:P 0.0 1,*:P 0.0 5)。通过这些分析,筛选出具有生物学和统计学意义的免疫细胞和相关通路1.2.8统计学分析方法两组间的两个变量之间的比较采用t检验。对于三组及以上组别的两个变量之间的比较采用Wilcoxon检验。涉及多个变量之间的比较采用Kruskal-Wallis检验。使用SPSS13.0软件对数据进行统计分析,视P2的差异基因。通过差异分析,我们得到了443个差异表达基因,其中包括284个上调基因、159个下调基因。为了更直观地展示差异基因的表
18、达情况,我们绘制了热图1E,展示了前50 个最显著差异基因的表达情况A15Group10申GSE166388GSE42632GSE5079012SM122M12B10050-100-GroupsGroupsGSE166388GSE166388GSE42632GSE42632-GSE50790GSE5079050-100-10010020100100)PC1(62.12%)PC1(21.12%)DEGroup12TNIP3CXCL8Down-rcgulationMMP12CXCL13NoncTCN1Up-regulationIGFL1RHCGS100A12IF144LPI3TNIP3S100A7
19、ASERPINB4DEFB4ADLGAPS1F16WNT2IFi44F14IF127S100A12iSG15GroupNRN1IGFBPSASBS1F127STMN2NormalSERPINB4MMP1ISG1SCENPFPsoriasisCACTG2KIF14MMPTCNDTOP2ADLGAPS2PBKPOSTNFOXQ1GALMSMB0ANKRD33BZDHHC11-1DKK1HSD11B12RPS4Y1Logz(Fold Change)HOXA13SGCGSULF2SYNPO2APOECXCL14CILPC11ORF96IGFBP5ASB5PARM1SYPL2GATA6WNT2ACTG2
20、CNN1箱式图1A展示数据的标准化结果、PCA分析图1B展示去除批次效应前的PCA结果;PCA分析图1C展示了去除批次效应后的PCA结果;火山图ID,标注了1ogFC2的差异基因;热图1E,展示了前50 个最显著差异基因的表达情况图1整合数据集样本归一化箱式图、PCA图和差异表达分析图(火山图、热图)Figure 1 Normalized box plot,PCA plot and differential expression analysis plot(volcano plot,heat map)ofthreedatasets2.2对银屑病模块特征基因的筛选结果对样本进行聚类,并通过设置阈
21、值来排除明显异常的样本,聚类树(图2 A)展示了2 8 个样本及其临床特征。软阈值()为6 时,无尺度网络的拟合指数大于0.8 5,使基因之间的关系矩阵接近无尺度网络(图2 B)。设置聚类高度截止值为0.25,得到2 4个模块(图2 C)供进一步分析。基因层级聚类热图(图2 D),原始模块和合并后的模块显示在聚类树下方。进一步分析模块之间的相关性结果显示,不同模块之间没有显著的相关性(图3A)。模块特征与临床特征之间的相关性结果显示,红色模块与P组呈正相关(r=0.58,P=0.001),与C组呈负相关(r=-0.58,P=0.0 0 1)(图3B)。47ASampledendrogram a
22、nd trait heatmapB180-ScaleindependenceMeanconnectivity140-120678910111213141516171819200.840001000.68O-3000-0.4360-400.2200020.0-21000-0.2-3-0.4-678910111213141516171819200Somadl51015205101520PsoriasisSoft Threshold(power)Soft Threshold(power)CClusteringofmoduleeigengenesDClusterDendrogram1.01.00.90
23、.8Height0.80.6Height0.40.70.20.60.0UMOJqepoJOAIcysnDynamic.Tree.CutMerged dynamic样本聚类树状图2 A,树叶对应于单个样本;无尺度网络构建图2 B,软阈值为6 时,使得无尺度网络的拟合指数达到0.8 5以上;图2 C为聚类高度截止值为0.2 5的聚类树状图;基因层级聚类热图2 D,原始模块和合并后的模块显示在聚类树下图2WGCNA分析图Figure 2WGCNA analysis chartABModule-traitrelationships1.278.98MEpalevioletred31.0MEmediump
24、urple38390.8MEsienna30.9037-9.00370.63-0.630.6MEdarkolivegreen(3e-04)(30-04)-0.66MEviolet(18-4)0.4MEbrown0.2MEthistle18.80.5MEdarkgreyMElavenderblush3MEgreenyellowMEorangeMEpaleturquoise0MEsaddlebrownMEblack0.80.0MEblue8MElightyellow0.6MEskyblue8.8288MEfloralwhite-0.5-0.488MEred0.2MEbrown48.35MEplum
25、20MEbisque4MEdarkredMEgreyPsoriasis图3A为模块特征基因的共线性热图,红色表示高度相关,蓝色表示相反结果;图3B为模块-特征相关性热图,红色代表正相关,蓝色代表负相关图3WGCNA分析热图Figure33Heatmapof WGCNAanalysis482.3对差异基因的功能富集分析结果将WGCNA分析所得的银屑病模块特征基因与差异表达基因取交集,选择P1作为筛选条件,绘制韦恩图展示这些基因的重叠情况(图4A),得到7 7 个重叠基因(包括ACE2、A CP5、AKR1B10、A NG PT L4、A NK RD 18 A、A NK RD 33B、APOBEC
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