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基于全基因组的栀子花香成分合成TPS基因系统分析.pdf
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1、DOI:10.11913/PSJ.2095-0837.23017许文杰,娄千,陈启桢,胡开治,曹敏,刘燕琴,韩蓉蓉,宋经元.基于全基因组的栀子花香成分合成 TPS 基因系统分析J.植物科学学报,2024,42(1):8595Xu WJ,Lou Q,Chen QZ,Hu KZ,Cao M,Liu YQ,Han RR,Song JY.Systematic analysis of TPS genes for the synthesis of floral aromacomponents of Gardenia jasminoides J.Ellis based on the whole genome
2、J.Plant Science Journal,2024,42(1):8595基于全基因组的栀子花香成分合成TPS基因系统分析许文杰1,娄 千1,陈启桢1,胡开治2,曹 敏2,刘燕琴2,韩蓉蓉2,宋经元1*(1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,国家中医药管理局中药资源保护重点研究室,北京 100193;2.重庆市药物种植研究所,重庆 408435)摘要:栀子(Gardenia jasminoides J.Ellis)花色洁白且香气怡人,不仅具有极高的观赏价值,还是重要天然香料来源。萜类是栀子花独特香气的主要组成成分,但合成该类挥发性产物的关键萜类合酶(TPS)尚未鉴定。本研究基于栀
3、子高质量基因组,通过转录组数据、系统发育树和保守结构域分析等,全面挖掘栀子萜类花香成分合成相关的 TPS 基因。结果显示,栀子基因组共注释到 44 个 GjTPS 基因,不均匀分布于 11 条染色体,其中 9 个 GjTPS 参与串联复制事件。所有 GjTPS 被划分为 5 个亚家族,其中 27 个属于被子植物特有的 TPS-a、TPS-b 和 TPS-g 分支。结合栀子 5 个器官的转录组数据及实时荧光定量 PCR 分析,筛选出 5 个候选 GjTPS 基因,其在盛开期的花器官中特异高表达,且含有 DDXXD 和 NSE/DTE 活性基序。其中,GjTPS1、GjTPS2、GjTPS3 和
4、GjTPS27 为 TPS-b 分支酶,推测为芳樟醇或罗勒烯等栀子主要花香成分合成酶,而 TPS-a 分支的GjTPS18 可能是金合欢烯合酶。关键词:栀子;花香;萜类合酶;基因组;转录组中图分类号:Q943.2文献标识码:A文章编号:2095-0837(2024)01-0085-11Systematic analysis of TPS genes for the synthesis of floral aromacomponents of Gardenia jasminoides J.Ellis based on the whole genomeXu Wenjie1,Lou Qian1,Ch
5、en Qizhen1,Hu Kaizhi2,Cao Min2,Liu Yanqin2,Han Rongrong2,Song Jingyuan1*(1.Key Laboratory of Chinese Medicine Resources Conservation,State Administration of Traditional Chinese Medicine of the PeoplesRepublic of China,Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Science and Pe
6、king Union Medical College,Beijing 100193,China;2.Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation,Chongqing 408435,China)Abstract:Gardenia jasminoides J.Ellis flowers are white in color and have a pleasant aroma.These flowershave high ornamental value and are an important source of natural spices
7、.Terpenes are the main compo-nents of the unique aroma of G.jasminoides flowers,but the key terpene synthases(TPSs)for the biosynthe-sis of such volatile products have not yet been identified.Here,based on the high-quality genome of G.jasmi-noides,this study comprehensively explored the TPS genes re
8、lated to floral scent biosynthesis through tran-scriptomic,phylogenetic,and conserved domain analysis.In total,44 GjTPS genes were identified in G.jasmi-noides,unevenly distributed on 11 chromosomes,and nine GjTPS genes participated in tandem duplicationevents.All GjTPSs were clustered into five sub
9、families,27 of which belonged to the angiosperm-specificclades,including TPS-a,TPS-b,and TPS-g.Combining transcriptomic data and quantitative real-time PCR 收稿日期:2023-03-17,接受日期:2023-05-21。基金项目:国家自然科学基金项目(82304674)。作者简介:许文杰(1990),女,博士,助理研究员,研究方向为植物次生代谢产物合成(E-mail:)。*通信作者(Author for correspondence.E-m
10、ail:)。植物科学学报2024,42(1):8595Plant Science Journalhttp:/(qRT-PCR)analyses of five organs,five candidate GjTPS genes,with high expression in blooming flowersand containing the active motif DDXXD and NSE/DTE,were screened.Among them,GjTPS1,GjTPS2,GjTPS3,and GjTPS27 were grouped in the TPS-b clade,specul
11、ated to be the TPSs responsible for thebiosynthesis of the main floral aroma components of G.jasminoides,such as linalool and ocimene,whileGjTPS18 from the TPS-a clade may be a farnesene synthase.Key words:Gardenia jasminoides;Floral scent;Terpene synthase;Genome;Transcriptome 植物独特的花香不仅是一种重要观赏性状,还具有
12、吸引授粉昆虫、驱避细菌病原体和蚂蚁等有害生物的功能1,2,有助于自身繁殖。随着香花植物资源的不断开发与利用,鲜花已经成为多种食品原料和天然香料来源3。植物花香由多种挥发性成分组成,主要包括萜类化合物、苯丙烷类/苯环型化合物和脂肪酸衍生物 3 大类4,其中萜类是自然界分布最广、种类最多的次生代谢产物5。研究表明,观赏性植物的花香成分多为单萜和倍半萜6,如罗勒烯、芳樟醇和金合欢烯。解析萜类花香成分的合成及调控机制可以辅助植物优良品种选育,目前已成为研究热点7-9。高等植物萜类成分的合成前体物由甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径提供10。异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸
13、(DMAPP)在香叶基焦磷酸合酶(GPPS)的催化下合成香叶基焦磷酸(GPP),GPP 可以与第 2 个 IPP 形成法呢基焦磷酸(FPP)。植物分别以 GPP 和 FPP 为底物,在萜类合酶(TPS)的催化下合成单萜和倍半萜类挥发性成分11。作为萜类合成关键酶,不同功能 TPS 的 N 端和 C 端均具有保守结构域12,13。根据 TPS 的催化功能和进化分布,可将其分为 7 个亚家族:TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-g、TPS-e/f 和 TPS-h14。TPS-a、TPS-b 和 TPS-g 是被子植物特有的 TPS分支。其中,TPS-a 分支酶主要催化合成倍半萜
14、和二萜,TPS-b 和 TPS-g 分支为单萜合酶,但TPS-g 分支酶的合成产物多为非环化的单萜类挥发性物质。TPS-f 分支由 TPS-e 分支演化而来,二者归为 TPS-e/f 分支,该分支与 TPS-c 和 TPS-d 分支的 TPS 参与裸子植物多种萜类的合成。茜草科栀子(Gardenia jasminoides J.Ellis)是世界著名的香花植物,鲜花香气浓郁且香甜怡人。栀子花精油和浸膏分别被广泛用于化妆品和食品,是重要的天然香料来源。此外,栀子花挥发性成分具有镇静、助眠、抗菌和抗氧化等功效15,16,可用于芳香疗法和制作花茶等,具有一定的保健功效和药用价值。卢路路等17对不同品
15、种和花期的栀子花挥发性物质进行分析发现,栀子花香由多种成分组成,不同品种及不同花期释放的香气均存在一定差异,但主要成分为罗勒烯、芳樟醇、金合欢烯和叶醇等萜类。徐晓俞等18使用顶空-气质联用法,在水蒸气蒸馏提取的栀子鲜花精油中分离鉴定出 150 种挥发性成分,其中萜烯类成分多达 48 种,罗勒烯和芳樟醇的含量分别为 19.68%和 17.70%,是栀子鲜花花香的主要成分。我国栀子种质资源丰富,栀子花具有较高的开发价值,但目前的相关研究主要集中于花香成分的提取及鉴定17-19,多种萜类花香成分合成关键酶 TPS 仍不清楚。植物花香成分的合成与释放呈动态变化20-22,有研究发现,索邦百合(Lili
16、umoriental Sorbonne)和马里兰金鱼草(Antir-rhinum majus Maryland True Pink)中萜类挥发性成分的产生和释放与相关 TPS 基因的时空特异性表达水平相关23,24。因此,明确栀子萜类花香成分合成基因 TPS 的种类及功能,可以为独特花香种质的培育提供靶基因。本研究基于已发表的栀子基因组25,以叶片、花蕾、盛开期花和幼嫩果实器官为材料,借助转录组测序及多种生物信息学分析手段,全面挖掘栀子萜类花香成分合成关键酶 TPS,以期为后续花香基因 TPS 的功能验证奠定基础。1材料与方法 1.1实验材料栀子新鲜器官样品采集于重庆市南川区,包括幼嫩叶片(Y
17、oung leaf,YL)、小花蕾(Smallflower bud,SFB,长约 2 cm)、大花蕾(Largeflower bud,LFB,长约 3 cm)、盛开期花(Bloo-86植 物 科 学 学 报第 42 卷ming flower,BF)和花后 6 周的果实(Fruit forsix weeks,F6W),每种器官 3 个生物学重复。采集的样品用蒸馏水冲洗干净,于液氮中速冻,放置于80 冰箱保存。1.2实验方法 1.2.1转录组测序及数据分析使 用 多 糖 多 酚 植 物总 RNA 提 取 试 剂 盒(TIANGEN,中国)提取栀子样品的总 RNA,每种器官 3 个生物学重复。委托上
18、海凌恩生物科技有限公司对 BF 和 F6W 样品进行转录组测序,YL、SFB 和 LFB 转录组数据为实验室前期数据26。使用 Hisat2 v.2.1.0 软件将测序得到的 Clean reads比 对 到 栀 子 参 考 基 因 组(NCBI 登 录 号:ASM1310374v1),借助 Cufflinks v.2.1.1 软件计算基因表达 FPKM 值。根据所有基因的FPKM 值,使用 R v.3.4.3 的 cor 函数及 corrplot 包计算样本间的基因表达相关系数,并绘制相关性图。1.2.2GjTPS 基因家族分析使用 InterProScan 软件对栀子蛋白序列进行注释,将同
19、时包含 PF01397 和 PF03936 结构域的 基 因 注 释为 TPS 基 因。使 用 Cell-PLoc 2.0(http:/ WoLF PSORT(https:/wolfpsort.hgc.jp/)在线工具,对 TPS 蛋白进行亚细胞定位分析。使用MEME 在线网站(https:/meme-suite.org/meme/)预测 TPS 蛋白的保守基序,数量设置为 50,长度为 550 个氨基酸。借助 TBtools v.1.108 软件绘制 TPS 基因编码产物的保守基序及基因结构图。从咖啡(Coffea)基因组数据库(http:/www.coffee-genome.org/)下载
20、中果咖啡(C.canepho-ra Pierre ex Froehn.)的基因组序列及注释文件。使用 MCScanX 软件的默认参数对栀子种内及栀子与咖啡的种间编码基因共线性进行分析,使用TBtools 软件绘制 Circos 图。1.2.3花香成分合成 GjTPS 基因的筛选通过 NCBI 数据库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)及 文 献 检 索,收 集 拟 南 芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.)、小果咖啡(C.arabica L.)、薰 衣 草(Lavandula angustifolia Diva、L.an-gustifolia
21、Mill.)、香 雪 兰(Freesia x hybrida Red River、Freesia x hybrida Ambiance)、番 茄(Solanum lycopersicum L.)和 大 冷 杉(Abies grandis(Douglas ex D.Don)Lindl.)的TPS 蛋白序列(表 1)。借助 MEGA v.7.0.26 软件的邻近法构建系统发育树,使用 JTT 模型,Bootstrap 值设置为 1 000。使用 iTOL 在线工具(https:/itol.embl.de/)绘制进化树。提取 TPS 基因在栀子所有器官中的表达值,使用 GraphPad v.9.5.
22、0 软件的非配对 t 检验进行基因表达差异显著性分析,借助 R 软件对基因表达值 Log10(FPKM+1)绘制表达聚类热图。结合系统发育树,筛选在盛开期花样本中高表达,且与已知功能 TPS 亲缘关系较近的 TPS 为栀子萜类花香成分合成候选基因。1.2.4候选 GjTPS 基因的 qRT-PCR 表达定量分析使用 PrimerQuest 在线工具(https:/sg.idtd- TPS 基因的 qRT-PCR 引物,扩增片段长度在 100 bp 左右,Tm 值为 60 左右。以栀子样本 cDNA 为模板,使用Bio-Rad CFX96 定量仪(Bio-Rad,美国)检测基因表达情况,每种器官
23、 23 个生物学重复,每个基因 3 个技术重复。qRT-PCR 反应体系为:10 LSYBRTM select master mix(CWBIO,中国);1 LForward primer;1 L Reverse primer;50100 ngcDNA;RNase-free ddH2O 补齐至 20 L。反应程序:95 1 min;然后 95 15 s,60 45 s,共 40 个循环。以栀子 ACTIN 为内参基因,YL 器官为对照组,使用 2Ct方法进行 GjTPS 基因表达相对定量分析。2结果与分析 2.1转录组测序数据分析本研究对栀子转录组数据进行统计,发现 15个样本的测序 read
24、s 数为 18 837 80831 854 250。根据课题组已有的栀子基因组注释信息,共获得35 967 个编码基因的表达值。相关性分析结果显示,每种器官 3 个生物学重复间的一致性较好,可以有效地反映基因的表达情况(图 1:A)。此外,根据热图可知,盛开期花的基因表达模式明显区别于其他器官,其与叶片、花蕾和幼嫩果实样本的基因表达相关系数均小于 0.1。盛开期花器官特有次生代谢产物合成及其调控基因的差异表达可能是导致该现象的原因之一,包括萜类合酶编码基因 TPS(图 1:B)。第 1 期许文杰等:基于全基因组的栀子花香成分合成 TPS 基因系统分析87 表 1不同物种的 TPS 蛋白信息Ta
25、ble 1Protein information of TPSs collected from multiple species蛋白名称Protein name蛋白编号Protein ID蛋白名称Protein name蛋白编号Protein IDFhrTPS18AtTPS02P0CJ43.1FhrTPS28AtTPS03A4FVP2.1FhrTPS48AtTPS06Q84UU9.2FhrTPS68AtTPS10Q9ZUH4.1FhaTPS78AtTPS11Q4KSH9.2FhaTPS88AtTPS12Q9T0J9.2SlTPS3G1JUH1.1AtTPS13Q9T0K1.2SlTPS5Q1X
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