高原性高血压人群和血压正常人群间肠道微生物和微生物代谢物的差异.pdf

3220242024年JOURNALANDBIOLOGYVol.45No.第45卷第1期杂志中国高原医与生物高原性高血压人群和血压正常人群间肠道微生物和微生物代谢物的差异*侯东海，唐才智，陈郁，罗勇军*（陆军军医大学陆军卫勤训练基地军事医学地理学教研室，重庆400038)摘要目的分析高原性高血压（ARH)人群和血压正常人群间肠道微生物和微生物代谢物的差异，探讨ARH的作用机制方法对ARH患者（n=7）和健康对照者（n=10）的粪便做16 SrDNA测序和代谢组学分析，并采用Spearman相关分析法探究肠道微生物与代谢物的相关性。结果从ARH组和对照组中筛选到2 3种差异代谢物，其中2,3-二羟基-3-甲基丁酸、泛酸、16-羟基棕榈酸和甘氨酰-L-亮氨酸等9种代谢物下调，尿嘧啶、2-氧己二酸、DL-3-氨基异丁酸、组胺和黄豆苷元等14种代谢物上调；经过KECG代谢通路分析，得到初级胆汁酸生物合成等11条差异代谢通路；通过16 SrDNA测序分析，在属水平上筛选出3种差异菌属，分别是双歧杆菌属（Bifidobacterium）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、链杆菌属（Catenibacterium）。经差异菌与代谢物相关性分析发现，消化链球菌、链杆菌水平与亚油酸水平等呈正相关；双歧杆等菌水平与2 0-羟基花生四烯酸、甘氨酰-L-亮氨酸水平等呈负相关。结论ARH受试者血压升高可能与肠道微生物失调导致的亚油酸、泛酸、2,3-二羟基-3-甲基丁酸下调有关；双歧杆菌等微生物丰度上调以及机体对组胺、黄豆元的富集可缓解血压的持续性升高关键词肠道；菌群；高原；高血压；非靶向代谢组学；关联；分析中图分类号R37文献标志码AD0110.13452/ki.jqmc.2024.01.005Differences of intestinal microbes and its metabolites betweenindividuals with altitude-related hypertension(ARH)andthose with normal blood pressure*HOU Donghai,TANG Caizhi,CHEN Yu,LUO Yongjun(Department of Military Medical Geography,Army Medical Training Base,The Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)Abstract Objective To analyze the differences in intestinal microbes between individuals with altitude-re-lated hypertension(ARH)and those with normal blood pressure,and to explore the action mechanism of ARH.Methods 16S rDNA sequencing and metabolomics analysis were performed on the feces of ARH patients(n=7)and healthy controls(n=10).Spearman correlation analysis was adopted to explore the correlation between intesti-收稿日期：2 0 2 3-0 9-11修回日期：2 0 2 4-0 1-0 2：国家自然基金面上项目（No.42377466），第二次青藏高原综合科学考察研究项目（2 0 19QZKK0607）；*：通信作者，教授，博土生导师，ajun-侯东海（1997 一），男，汉族，四川籍，硕士研究生学历33nal microbes and metabolomics.Results A total of 23 differential metabolites were detected from ARH group andthe control group.Among them,9 metabolites such as 2,3-dihydroxy-3-methylbutyric acid,pantothenic acid,16-hydroxypalmitic acid and glycyl-1-leucine were downregulated;a total of 14 metabolites including uracil,2-oxa-dipic acid,DL-3-amino-isobutyric acid,histamine and daidzein were upregulated.A total of 11 differential meta-bolic pathways including primary bile acid biosynthesis were identified after KECG metabolic pathway analysis.Through 16S rDNA sequencing analysis,three different bacteria were selected at the genus level,including Bifido-bacterium,Peptostreptococcus and Catenibacterium.The correlation analysis between differential bacteria and me-tabolites showed that both Streptococcus digesticus and Streptococcus were positively correlated with the level of lin-oleic acid.Bifidobacterium was negatively correlated with 20-hydroxy-arachidonic acid and glycine-L-leucine.Conclusion The elevated blood pressure in ARH group may be related to the downregulation of linoleic acid,pan-tothenic acid and 2,3-dihydroxy-3-methylbutyric acid caused by intestinal microbes imbalance.The upregulationof Bifidobacterium and other microorganisms,together with the bodys enrichment of histamine,daidzein and othermetabolites may alleviate the persistent increasing of blood pressure.Keywords intestinal;bacterial flora;plateau;hypertension;non-targeted metabolomics;correlation;analysis急进高原时，部分人群由于对高原缺氧环境适应不良，产生持续性高血压，当返回平原后，血压会回落至正常基线水平，称之为高原性高血压（alti-tude-related hypertension,ARH)。目前,导致ARH患者血压变化的确切机制仍不明确。有研究认为肠道菌群及其代谢物的差异性变化对高血压的发生、发展产生重要影响2。普氏杆菌属（Prevotella)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)的低丰度可能导致高血压3,双歧杆菌和干酪乳杆菌等益生菌能抑制心血管疾病发生4-1。一些病原梭菌如梭状芽孢杆菌（Clostridiumasparagiforme）、艰难梭菌（Clostridiumdifficile）、哈氏梭菌（Clostridiumhathewayl)等，肠球菌属屎肠球菌(Enterococcus faecium）以及脱硫弧菌属（Desulfovi-brio）,它们与心血管疾病发生相关,这些肠道微生物能产生三甲胺（trimelliticanhydride，T M A），导致氧化三甲胺(trimetlylamine oxide,TMAO)的积累，促进血管氧化应激反应,最终诱发高血压等心血管疾病5-6。本研究通过分析ARH人群和血压正常人群间肠道微生物和微生物代谢物的差异，探讨ARH的作用机制1材料与方法1.1研究对象选择对到达高海拔地区（42 0 0 m）的健康中国青年男性志愿者进行血压测量，早晚各测量一次,共测量三天。若血压在三天内均超过阈值（收缩压 140 mmHg，和/或舒张压 90 mmHg)归为ARH组（n=7）,未超阈值者归为对照组(n=10)。两组受试者年龄、体重指数(bodymass index,BMI）、饮食结构和生活习惯等方面的差异均无统计学意义（P0.05）,受试者生理指标测量结果见表1。研究方案经第三军医大学人类伦理委员会批准(批准号：No.011-02,2020)。表1受试者生理指标Table1Physiological indicators of the subjects样本年龄（岁）体重指数收缩压/舒张压（mmHg)血氧心率（次）2021.30144.67/97.3385.3377.332220.90148.33/90.3384.3395.672321.71160.33/93.0081.6766.00ARH组2321.72155.33/98.3383.6791.672223.46143.67/94.0087.3387.002021.07150.67/98.0083.6780.002320.37149.00/97.6688.6778.0034续表1样本年龄（岁)体重指数收缩压/舒张压(mmHg)血氧心率（次）1920.52102.00/83.0084.3393.001921.48119.00/63.0075.0081.332022.95117.00/81.0084.3391.002319.97112.33/72.0092.6795.001921.39113.33/72.6790.3370.00正常组2220.02104.00/72.3396.3371.332222.45119.00/79.0084.6772.672521.33108.00/82.3385.3378.002220.21115.33/67.6785.3377.332120.64100.00/75.0086.3399.33注：血压、血氧和心率取3次平均值1.2样品处理早餐前统一采集粪便样本，并装人无菌塑料管中，置-8 0 冰箱冷冻储存。取10 0 mg粪便样本加人50 0 L提取液（氯仿：甲醇=3:1,v/v）以2-甲基戊酸为内标，用超声方式（2 0 min）提取，离心（10 0 0 0 g，15m i n），加人2 0 0 L50%的乙腈复溶，涡旋（0.5min），样本在4下离心（12 0 0 0 g，15mi n），取上清液置4冰箱备用7 1.33LC-MS检测取上清液过滤膜（0.2 2 m）人进样瓶，做超高效液相色谱（ultra high pressure liquid chromatogra-phy,UHPLC)分析。从每个样本中各取2 0 L混合成质控(QC)样本,用于监测仪器稳定性。采用Agi-lent1290InfinityLC系统（安捷伦，德国）的UHPLC系统亲水作用色谱柱（hydropinteractionliquidchro-matography,HILIC)(4.6mmx150 mm,5 m)进行样品分离。柱温：50;流速：0.35mL/min；进样量：5L；流动相组成A：0.1%甲酸溶液，B：乙睛；使用梯度洗脱，流动相梯度洗脱程序如表2 所示。采用ESI离子源模式检测（正负离子切换下进行）。ESI源条件如下，采集m/z范围：50 150 0 Da，气帘气：40 psi，雾化气：55psi，辅助气：55psi，离子源加热温度：550，源喷雾电压：550 0 V（正负两种模式），去簇电压：10 0 V，碰撞能量：3515eV，鞘气流速：30Arb，辅助气流速：13Arb。采用高灵敏度模式。1.4肠道微生物的DNA提取、测序和鉴定表2流动相梯度洗脱程序Table 2Mobile phase gradient elution procedure时间/min流速/mLmin-l流动相A/%流动相B/%初始值0.35901010.35802050.35307080.3520809120.3559513150.359010按照E.Z.N.A.BacteriaDNAkit试剂盒操作要求提取各组粪便样品基因组DNA,并用琼脂糖凝胶电泳仪检测。使用通用引物（343F：5-T A CG-GRAGAGCAG-3;798R:5-AGGGATCTAATCCT-3）进行细菌16 SrDNA基因的聚合酶链式反应(PCR）,扩增区域为V3V4高变区，所得PCR产物用35汾析高通量测序仪测序和分析。将测得的基因组数据与NCBI数据库比较，以此确定属水平1.5差异代谢物与差异微生物的筛选与相关性分析采用单因素分析法筛选差异代谢物。采用t检验和foldchanges（f c）比较两组间代谢物的数量差异，并绘制火山图，并以1logzFC11且P1且P4和P0.05。采用Spearman统计法分析差异代谢物与差异微生物之间的相关性。1.6差异代谢物与差异微生物的筛选及相关性通过在线工具MetaboAnalyst 5.0(https:/www.metaboanalyst.ca/）门分析差异代谢物的代谢途径，筛选（富集因子设置为大于0.10)潜在的关键代谢途径。1.7数据处理采用IBMSPSSStatistics26.0版软件分析数据、Origin2019b软件制图。组间比较采用t检验，计量资料用均数标准差(x土s)表示，组间比较采用单因素方差分析和多维统计分析。如果方差不均匀,则使用非参数秩和检验,P4,P0.05），分别是双歧杆菌属（Bifidobacterium）、消化链球菌属（Peptostrepto-coccus）、链杆菌属（Catenibacterium）。使用Spear-man相关分析法对差异菌属和差异代谢物的数据进行关联分析，获得的数值矩阵通过热图直观展示，结果见图6。可以看出，双歧杆菌与2 0-羟基花生四烯酸（r=-0.69）、甘氨酰-L-亮氨酸（r=-0.55）、16-羟基棕榈酸（r=-0.58）等成负相关（P0.05），与2-氧已二酸（r=0.48）、天门冬氨酸（r=0.59）和香草酸（r=0.43)成正相关（P0.05）；消化链球菌与亚油酸（r=0.39)成正相关（P0.05）；链杆菌与16-羟基棕榈酸（r=0.66）、亚油酸（r=0.61）、吲哚乙酸（r=0.42）成正相关(P0.05)。0.60.40.20-0.2*双歧杆菌-0.4-0.6消化链球菌大链杆菌大*5,10-亚甲基四氢呋喃(S)-2-羟基戊二酸酯2,3-二羟基-3-甲基丁酸吡咯烷20-羟基花生四烯酸甘氨酰-L-亮氨酸吲哚乙酸肌醇牛磺脱氧胆酸天门冬氨酸D-甘露糖泛酸16-羟基棕榈酸组胺2-氧己二酸香草酸DL-3-氨基异丁酸胆酸牛磺胆酸盐黄豆苷元芥酸亚油酸尿嘧啶图6 ARH组和对照组肠道显著性差异菌群与差异代谢物的相关性热图Figure6Thermal maps of significant different intestinal microbes and metabolites betweenARH group and the control group403讨论相关研究表明，暴露于高海拔后，部分人群会出现高血压8。因此，本研究力求通过多组学研究方法探究高原高血压症应激反应特征，用以指导疾病的预防和治疗。本研究通过超高效液相色谱质谱联用（ultra high pressure liquid chromatography-mass spectrum，U H PLC-M S)的非靶向代谢组学手段来检测ARH与血压正常人群的粪便内源性代谢物,结果发现，ARH患者与血压正常者的粪便代谢物存在显著性差异，共筛选出2 3种差异代谢物，主要富集在11条代谢通路。其中，ARH组的2,3-二羟基-3-甲基丁酸、亚油酸、2 0-羟基花生四烯酸、泛酸、16-羟基棕榈酸等代谢物含量显著降低。亚油酸和花生四烯酸具有降低血压的效果。本实验中的ARH组不饱和脂肪酸合成途径受到抑制，粪便中亚油酸的含量较对照组显著降低，提示亚油酸和20-羟基花生四烯酸含量降低影响了血压的升高。泛酸是乙酰辅酶A（乙酰CoA)的前体，泛酸在人体内参与泛酸盐和辅酶A生物合成10 并生成为三羧酸循环提供能量。在本实验中泛酸值下降，推测是2,3-二羟基-3-甲基丁酸大幅下调所致，该物质是生物合成泛酸和辅酶A的直接前体。棕榈酸能引起心肌细胞中nNOS及蛋白CPT-I增加，进而对高血压大鼠心肌收缩力发挥抑制作用，有效降低血压1。上述四种物质的降低与血压升高密切相关，这和前人众多的研究结果一致。本研究中，胆酸和牛磺脱氧胆酸、牛磺胆酸盐代谢物含量增加，它们都属于初级胆汁酸，共同影响着初级胆汁酸生物合成通路的生物过程。胆汁酸是11-羟化固醇脱氢酶型的内源性抑制剂，当胆汁酸代谢发生障碍反流人血时，抑制11-羟化固醇脱氢酶型活性，促进皮质醇激活盐皮质激素受体12,致钠潴留使血压升高。本实验结果表明，由于初级胆汁酸过多导致初级胆汁酸生物合成代谢通路发生障碍，胆汁酸反流人血致总胆汁酸水平升高，引发急性高海拔暴露人群的血压升高。组胺是一种强效的胃分泌兴奋剂，能促进胃酸分泌，它也是一种血管舒张剂，直接作用于动脉血管和毛细血管，有效促进血压降低；黄豆苷元可抑制人脐动脉平滑肌的增殖从而辅助降低血压。在ARH组中的此二种物质含量明显增加：虽然机体处于稳态失衡中，但仍致力于调控相关代谢物丰度来促进血压降低。此外，ABC转运蛋白通路明显受到影响，该类蛋白的确在肠道、肾脏和肝脏等上皮细胞高表达(13,与物质交换相关。有研究表明,缺氧或缺血时大鼠脑毛细血管细胞膜上的跨膜糖蛋白P-GP的活性受到抑制14，可以推测高原缺氧环境也可能影响小肠转运蛋白活性，从而使得血压改变。粪便代谢物被认为是肠道菌群和宿主共代谢的产物，它不仅可以反映肠道菌群的状态，而且在共栖菌与宿主之间起着桥梁作用15为了探讨ARH与血压正常对照组肠道菌群的差异变化机制，本研究采用16 SrDNA观察粪便中存在的显著性差异菌群，筛选出三种属水平的菌群，分别是双歧杆菌属（Bifidobacterium）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、链杆菌属（Catenibacteri-um）。研究发现，双歧杆菌属于益生菌，一共有32个亚型，生物制剂多达7 0 种，双歧杆菌可预防DOCA-盐高血压，具有降胆固醇和降压特性16 消化链球菌丰度增加与动脉压降低之间呈弱负相关，而链杆菌与消化链球菌都与肠道免疫稳态有关。许多研究证实高血压与肠道微生物失衡密切相关17,高血压患者的肠道微生物多样性和丰度明显降低3,采用动物模型进行验证，发现患病小鼠肠道微生物中厚壁菌门（Bacillota）和拟杆菌门（Ba c t e r o i d e t e s）丰度增加18)，乳酸杆菌（Lactobacil-lus)和双歧杆菌丰度降低19.2 0,通过回补实验发现小鼠的血压得到了一定程度的恢复,且有研究表明肠道微生物失衡在高血压发生之前出现18。本课题所研究差异菌群中的链杆菌和消化链球菌均属于厚壁菌门微生物，双歧杆菌隶属于放线菌门，而此二种菌群均为肠道菌群中的优势微生物17，提示ARH患者肠道微生物存在相当程度的失调现象。为了探讨肠道菌群与代谢物是否有依赖关系，本研究对肠道菌群与代谢组进行了关联分析。结果显示，ARH组与对照组的差异菌双歧杆菌与2 0-羟基花生四烯酸、甘氨酰-L-亮氨酸的水平成负相关，与2-氧已二酸、天门冬氨酸的水平成正相关（P 0.0 5），与此同时，关联分析还显示消化链球菌和链杆菌都与亚油酸的水平成正相关。值得注意的是,虽然亚油酸和2 0-羟基花生四烯酸的降低会加重高血压症状，但高血压患者肠道内的双歧杆菌丰度高，这将有利于血压的降低，说明当血压升高时，肠道微生物种类也会随之发生改变，失衡环境造成双歧杆菌属物种占据优势地位，使得机体朝有利于机体稳态的方向进行。这和Santisteban41等19采用小鼠模型发现高血压组双歧杆菌丰度低于对照组的结果不同，这可能是由于取样时间不同所致。研究表明，高原低压低氧环境会引起机体一系列的应激反应，健康人进人高原后，机体出现循环系统功能性代偿，血浆内皮素增加，一氧化氮降低，同时血浆肾素活性和血管紧张素水平增高，最终造成血压升高2 1。贺迎春2 2 对大鼠进行缺氧性实验发现，大动脉平滑肌的肌细胞A7r5中的CALM2基因明显上调,致调控血管收缩使血压升高。据报道，肠道微生物可以参与生命活动的调节，参与包括宿主糖代谢、氨基酸/蛋白质代谢、脂质代谢和免疫系统调控、脑肠神经系统调控等，并主要通过产生短链脂肪酸、氧化三甲胺、对甲酚、胆汁酸、组胺、脂多糖和一些毒素等代谢物来发挥调控作用，它们与肥胖、代谢综合征、肠易激综合征和心血管疾病密切相关4-6.2 3,这与本研究结论有相似之处。结合本研究结果猜测，高原低压低氧环境导致内环境紊乱，肠道环境及肠道微生物受到影响，致代谢和物质交换失衡，使血压升高。综上所述，本研究通过肠道菌群及代谢组学联合分析证实，与血压正常组相比，ARH组可通过调控肠道菌群双歧杆菌属、消化链球菌属、链杆菌属等菌属丰度，进而调控亚油酸、2 0-羟基花生四烯酸、甘氨酰-L-亮氨酸、2-氧已二酸等2 3种差异代谢物所涉及的11条代谢通路，造成急性高海拔条件下人群血压升高。需特别注意的是，机体会富集组胺、黄豆苷元等化合物，促进血压降低，而此二种物质的富集是否源于人体代谢或者肠道微生物分解尚不明确,有待进一步研究。此外，双歧杆菌等肠道菌群显示出机体对高血压的适应性变化，这表明益生菌对机体生命活动具有调节和改善作用，其互作机制有待进一步探索。虽然本研究初步判定ARH患者血压升高与肠道菌群失衡和代谢变化相关，但仍不足以建立两者的直接联系，后续应加大样本量，建立小鼠模型，检测ARH样本肠道菌群和代谢物指标的动态变化，以期阐明ARH的作用机制参考文献1Cianfranco P,Grzegorz B,Andrea F,et al.Changes in24 h ambulatory blood pressure and effects of angiotensin II re-ceptor blockade during acute and prolonged high-altitude expo-sure:a randomized clinical trial JJ.European heart journal,2014,35(44):3113-3121.2Yang WY,Jesus D.Thijs Melgarejo,Lutgarde,et al.As-sociation of office and ambulatory blood pessure with mortalityand cardiovascular outcomesJJ.JAMA,2019,322(5):409.3Li J,Zhao F,Wang Y,et al.Gut microbiota dysbiosiscontributes to the development of hypertension J.Microbiome,2017,5(1):14.4丁瑞雪，武俊瑞，岳喜庆，等.益生菌对肠道营养健康调控作用的研究进展J.中国乳品工业，2 0 18,46（1）：9.5Ghosh TS,Shanahan F.&OToole PW.The gut micro-biome as a modulator of healthy ageingJ.Nature Reviews Gas-troenterology&Hepatology,2022(19):565-584.6Gacesa R,Kurilshikov A,Vich Vila A,et al.Environ-mental factors shaping the gut microbiome in a Dutch popula-tion J.Nature Reviews Gastroente-rology and Hepatol ogy,2022(604):732-739.7马瑞岚，陈新利，于锋，等.冠心病患者氯吡格雷群体药动学-药效学模型研究J.中国现代应用药学，2 0 2 2，39(1):101-106.8贺曾.聚乙二醇修饰的不同粒径纳米金颗粒对红细胞功能的影响及其血液相容性研究D.北京：协和医学院，2 0 2 0.9 Duke CB,Sallade TD,Starling J,et al.Hypertensionand acute mountain sickness in himalayan trekkers in Nepal:An Observational Cohort Study LJ.Wilderness&Environmen-tal Medicine,2020,31(2):157-164.1oZhou Q,Song N,Wang SQ,et al.Effect of Gegen Qin-lian Decoction on hepatic gluconeogenesis in ZDF rats withtype 2 diabetes mellitus based on the farnesol X receptor/ce-ramide signaling pathway regulating mitochondrial me-tabo-lism and endoplasmic Reticulum stress J.Evidence-BasedComplementary and Alternative Medicine,2021:9922292.11权丽娜.nNOS和CPT-I对棕榈酸诱导的高血压大鼠心肌细胞收缩力的影响D.延吉：延边大学，2 0 19.12陈帅，陆登成，王维，等.基于UPLC-Q-TOF/MS的自发性高血压大鼠血浆代谢组学研究J.中西医结合心脑血管病杂志,2 0 2 1,19(18)：310 8-3112.13张丹丹，叶晓川.基于肠道菌群和代谢组学探讨茯苓酸性多糖宁心的作用机制J.中华中医药杂志，2 0 2 2,37(5):2575-2583.14马云芳，梁国鲁，裴得胜，等ABC转运蛋白研究的新进展J.生物技术通报，2 0 0 8,196(5)：35-41.15刘艳青，赵永芳.ABC转运蛋白结构与转运机制的研究进展J.生命科学,2 0 17,2 9（3）：2 2 3-2 2 9.16Antia AG,Magdalena K,Mayada Y,et al.Bifidobacte-rium bacteraemia is rare with routine probiotics use in preterminfants:A further case report with literature review J.Anaer-obe,2023,80(29):10-12.42（责任编辑：陈芃）17谢丹,张沐诗，李树春.肠道菌群与高血压相关性的研究进展J.实用医药杂志，2 0 19,36（2）：17 7-18 1.18Nelson J,Adnan S,Ajami N,et al.Alterations in thegut microbiota can elicit hypertension in rats J.The FASEBJournal,2017,49(2):96-104.19 Santisteban MM,Qi Y,Zubcevic J,et al.Hyperten-sion-linked pathophysiological alterations in the Gut JJ.Circu-lation Research,2016,120(2):312-323.20 Wilck,Matus N,Kearney MG,et al.Salt-responsivegut commensal modulates TH17 axis and disease Link JJ.Na-ture,2017,551(7682):585-589.21刘阳,黄岚.高原环境对动脉血压影响的研究进展J.医学综述,2 0 14,2 0(6)：96 3-96 6.22贺迎春.高原环境对机体主要生理和代谢指标影响的研究D.成都：成都中医药大学,2 0 19.23 Flint HJ,Scott KP,Louis P,et al.The role of the gutmicrobiota in nutrition and healthJ.Nature Reviews Gastroen-terology&Hepatology,2012,9(10):577-589.