黄芪甲苷对阿霉素诱导的HL-1细胞凋亡的抑制作用及机制研究.pdf
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1、基础研究黄芪甲苷对阿霉素诱导的 HL-1 细胞凋亡的抑制作用及机制研究贾婷1,崔梁瑜2,祁玉营3,刘欢1,薛松妍1,王方圆1,马静1(1.空军军医大学第一附属医院中医科,陕西西安 710032;2.中国中医科学院中医临床基础医学研究所,北京100700;3.西北大学生命科学学院,陕西西安710069)摘要:目的探讨黄芪甲苷(astragalosideIV,ASIV)对阿霉素诱导 HL-1 细胞凋亡的影响及机制,为进一步研发治疗阿霉素诱导心肌损伤的新药提供可靠的实验依据。方法将 HL-1心肌细胞分为正常对照组(Control 组)、模型组(Model 组)、1mol/LASIV、2mol/LAS
2、IV及 4mol/LASIV组等 5 组。用5.2mol/L 的DOX溶液放入细胞培养箱中培养12h 制备心肌细胞损伤模型后,以 1mol/L、2mol/L、4mol/L的ASIV溶液加入细胞损伤模型中,再放入细胞培养箱中培养 12h。CCK8法确定阿霉素造模药物浓度,流式细胞术确定浓度阿霉素造模时间,荧光染色法检测不同浓度 ASIV 对阿霉素诱导的 HL-1 心肌细胞凋亡、线粒体膜电位水平及 ROS 水平;分光光度检测法检测 ASIV对阿霉素诱导的 HL-1心肌细胞上清 NO 含量。结果5.2mol/L 的 DOX培养 12h 诱导 HL-1心肌细胞凋亡模型。与 Model 组相比,2mol
3、/L和 4mol/LASIV 组细胞凋亡明显减少(P0.01),NO 含量显著增加(P0.01);ASIV 各剂量组 AnnexinV-FITC 表达均有降低趋势(P0.01)、ASIV1mol/L、ASIV2mol/LMito-TrackerRedCMXRos 表达均明显升高(P0.05),ASIV4mol/LMito-TrackerRedCMXRos 表达均明显升高(P0.01),ASIV1mol/L、ASIV2mol/L 和 ASIV4mol/L 组 ROS 表达显著降低(P0.05)。结论ASIV 可通过减轻心肌细胞膜电位下降,降低 ROS表达,提高NO 含量,减轻氧化应激损伤,从而抑
4、制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡,且呈剂量依赖性。关键词:黄芪甲苷;阿霉素;HL-1 细胞;细胞凋亡;氧化应激中图分类号:R285文献标识码:A 文章编号:1009-7236(2024)02-0144-06DOI:10.12125/j.chj.202306065开放科学(资源服务)标识码(OSID):网络出版地址:http:/ effect of astragaloside IV on adriamycin-induced HL-1 cellinjury and its mechanismJIA Ting1,CUI Liang-yu2,QI Yu-ying3,LIU Huan1,XUE Song-y
5、an1,WANG Fang-yuan1,MA Jing1(1.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,FirstAffiliatedHospital,AirForceMedicalUniversity,Xian 710032,Shaanxi,China;2.Institute of Basic Research in Clinical Medicine,China Academy ofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;3.CollegeofLifeScience,NorthwestUniversity,X
6、ian710069,Shaanxi,China)Abstract:AIMToinvestigatetheprotectiveeffectofastragalosideIV(ASIV)ondoxorubicin-inducedHL-1 cell injury and its related mechanism,and to provide cardiac therapy for doxorubicin-inducedmyocardialinjury.METHODSHL-1cardiomyocytesweredividedintonormalcontrolgroup,modelgroup,1mol
7、/LASIVgroup,2mol/LASIVgroupand4mol/LASIVgroup.ThemyocardialcellinjurymodelwasmadewithDOXsolutionof5.2mol/Landculturedinacellincubatorfor12h.ASIV基金项目:国家中医药管理局中医药科学技术研究专项(GZY-KJS-2021-004);陕西省中医药管理局中西医结合临床协同创新项目(2020-ZXY-001);陕西省中医药管理局项目(2021-ZZ-GC-015)通讯作者:马静,主任医师,主要从事中医药防治心血管病的临床与基础研究Email:共同通讯作者:王方
8、圆,主治医师,主要从事中医药防治心血管病的临床与基础研究Email:wfy_作者简介:贾婷,硕士生Email:144心脏杂志(ChinHeartJ)2024,36(2)solutionsof1mol/L,2mol/Land4mol/Lwereaddedintotheculturebottlesofthecorrespondinggroupsandthentheywereplacedintothecellcultureboxforculture.After12hours,theASIVsolutionswereremovedtodetecttherelevantindexes.CCK8metho
9、dwasusedtodeterminetheconcentrationofadriamycinmodelingdrug,flowcytometrywasusedtoobservetheconcentrationofadriamycinmodelingtime,and fluorescence staining was used to detect the level of apoptosis,mitochondrial membranepotentialandROSofadriamycininducedHL-1cardiomyocytesbyASIV.ThecontentofNOinthesu
10、pernatant of adriamycin induced HL-1 cardiomyocytes was detected by spectrophotometry.RESULTS The model concentration of adriamycin was 5.2 mol/L.The apoptosis time of HL-1myocardial cells induced by adriamycin was 12h.After adriamycin administration,apoptosis wassignificantlyincreasedinmodelgroup(P
11、0.01)anditsignificantlydecreasedin2mol/Land4mol/LASIVgroups(P0.01).Comparedwiththoseinmodelgroup,ROSexpressionwasdecreasedandNOconcentrationandmitochondrialintimapotentialwereincreasedinASIVtreatmentgroups.In4mol/LASIVgroup,ROSconcentrationwassignificantlydecreased,whileNOconcentrationandmitochondri
12、alintimapotentialweresignificantlyincreased(P0.05).CONCLUSIONASIVmayinhibitadriamycininduced cardiomyocyte apoptosis in a dose-dependent manner by reducing the decline of membranepotentialofcardiomyocytes,reducingROSexpression,increasingNOcontent,andalleviatingoxidativestressinjury.Key words:astraga
13、losideIV;adriamycin;HL-1cell;cellapoptosis;oxidativestress阿霉素(doxorubicin,DOX)是治疗实体瘤和血液系统恶性肿瘤的蒽环类药物的有效药物之一1,但心脏毒性却限制了其在临床的应用,这种心脏毒性,因可导致的心力衰竭比引起的骨髓抑制、肾脏毒性以及消化道疾病更加危险2。研究表明3,DOX 心脏毒性与线粒体依赖的心肌细胞凋亡及氧化应激和炎症等多种机制相关。由于目前仍无特异性的有效的治疗方法,而受到心血管疾病和肿瘤防治领域的学者们的广泛关注。中药不仅可以明显缓解 DOX诱导的心悸、气短及呼吸困难等症状,而且可以改善心脏功能4。研究表明
14、,黄芪保心汤治疗扩张型心肌病心力衰竭效果显著,能改善患者心功能,调节神经内分泌细胞因子水平,且安全性高5。作为中药黄芪的核心活性单体成分的黄芪甲苷(astragalosideIV,ASIV),因其具有着良好口服吸收率、类药性和溶解性而具有较好的药物研究价值6。近些年,ASIV已被诸多药理学研究证实具有促进血管生成、抑制氧化应激、抑制心肌损伤等方面的作用7,但目前其对 DOX 诱导的 HL-1 心肌细胞损伤的保护作用及机制未见报道。本研究拟采用流式细胞术、荧光染色和分光光度法等,观察 ASIV 对 DOX诱导的 HL-1 心肌细胞凋亡、线粒体膜电位和活性氧(reactiveoxygenspeci
15、es,ROS)水平及一氧化氮(NO)含量的影响,探讨 ASIV 对 DOX 诱导的 HL-1心肌细胞凋亡的保护作用及机制,为进一步研发防治DOX 造成的心肌损伤新药提供可靠的实验依据。1材料和方法1.1材料处于对数生长期 HL-1 小鼠心肌细胞系,购自北京晶莱华科生物技术有限公司。黄芪甲苷(美国,Rskbio 公司),细胞与组织裂解液(中国,Beyotime 公司),细胞用二甲基亚砜(DMSO)和喜树碱原液(美国,Sigma 公司),MEM 液体培养基(美国,HyClone 公司);CCK-8 试剂盒(中国,MedChem-Express 公司),线粒体膜电位与细胞凋亡检测试剂盒(中国,碧云天
16、生物技术有限公司)、流式细胞术检测试剂盒(美国,BDBiosciences 公司),ROS 检测试剂盒、NO 检测试剂盒(中国,碧云天生物科技有限公司)。Coulter-XL 流式细胞仪(美国,Beckman 公司),激光共聚焦显微镜(日本,Olympus 公司),全自动酶标仪(澳大利亚,Tecan 公司),显微成像系统(德国,CarlZeiss 公司)倒置荧光显微镜(日本,Olympus公司)。1.2方法1.2.1模型制备与分组将 HL-1 小鼠心肌细胞分为对照组(Control 组)、模型组(Model 组)、ASIV1mol/L 组、ASIV2mol/L 组及 ASIV4mol/L 组等
17、 5 组。Model 组为加入 5.2mol/L 的 DOX 培养12 h,ASIV 1 mol/L、ASIV 2 mol/L 及 ASIV4mol/L 组分别在模型制备成功后,分别加入1mol/L、2mol/L、4mol/L 的 ASIV 培养 12h,Control 组直接用细胞培养液处理细胞 24h。心脏杂志(ChinHeartJ)2024,36(2)1451.2.2CCK8 法将 HL-1 心肌细胞培养 24h。观察细胞密度90%时,在培养板中加入不同浓度(0、0.3125、0.625、1.25、5 和 10mol/L)的 DOX 溶液,再培养 12h 后,加入 CCK-8 溶液,培养
18、 2h;避光,全自动酶标仪中检测,吸光度设置为 450nm,最后使用 GraphPad 软件进行分析并计算 IC50 值,即凋亡细胞与全部细胞数之比等于 50%时所对应的浓度。1.2.3流式细胞术将 HL-1 心肌细胞培养 24h,当贴壁细胞密度90%时,加入 5.2mol/L 的 DOX溶液,分别培养 12h 和 24h,并收集细胞,离心,洗涤,加入 200L1bindingbuffer,避光条件下,加入染料,室温避光孵育 15min,再加入 200L1bindingbuffer,避光上机检测,最后使用 EXPO32ADCAnalysis 软件进行凋亡分析。1.2.4荧光染色法在凋亡诱导结束
19、后,离心机1000g 离心 5min,PBS 洗涤,首先加入 188LAnnexinV-FITC 结合液,其次加入 5LAnnexinV-FITC,再加入 2LMito-TrackerRedCMXRos 染色液。避光孵育(2030)min,冰浴。荧光显微镜观察,Mito-TrackerRedCMXRos 为红色荧光,AnnexinV-FITC 为绿色荧光;将 HL-1 心肌细胞培养 24h,细胞收集后悬浮于稀释好的 DCFH-DA 中,37C 细胞培养箱内孵育 20min。使 DCFH-DA荧光探针和细胞充分接触。洗涤细胞,在阳性对照孔中加入Rosup 作为阳性对照,激光共聚焦显微镜观察 RO
20、S水平,使用的激发波长为 488nm、525nm。利用ImageJ 对细胞荧光进行定量分析,得到平均荧光强度值后利用 GraphPad 进行作图。1.2.5分光光度法将细胞用裂解液裂解,离心,取上清,按 50l/孔,在 96 孔板中加入标准品及细胞上清,按 50l/孔,同时加入室温 GriessReagentI,按 50l/孔,再加入室温 GriessReagentII,用全自动酶标仪测定 540nm 吸光度,根据标准品曲线计算出样品中 NO 的浓度。x1.3统计学处理采用 SPSSStatistics25.0 统计,数据以均数加减标准差(s)表示,组间比较采用单因素方差的方法进行分析,若方差
21、齐则用 Least-significantdiffererce 方法检验,若方差不齐则使用DunnettsT3检验,以 P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1不同浓度 DOX 对 HL-1 细胞损伤的影响0mol/L、0.3125mol/L、0.625mol/L、1.25mol/L、5mol/L 和 10mol/L 的 DOX 溶液均可抑制 HL-1心肌细胞生长,见表 1;其毒性作用先随 DOX 溶液浓度升高而升高(P0.01),DOX 浓度为 1.5mol/L左右时,细胞抑制率达到最大值,而后随着 DOX 浓度升高,细胞抑制率开始下降,经 GraphPad 分析DOX 浓度 5mol/
22、L 与其他各组的浓度差异最显著(P0.01),得到细胞达到半数凋亡(IC50)的 DOX 浓度为 5.2mol/L,见图 1。表1DOX 溶液浓度与细胞抑制率的变化DOX溶液浓度(mol/L)OD值细胞抑制率(%)101.100.1127.7110.52b50.800.0153.572.252.50.610.0269.333.54b1.250.580.0272.193.92b0.6250.620.0368.604.17b0.31250.640.0166.713.40b01.410.041.445.09n=4。与5mol/L组比较,bP0.0110080604020bbbb005DOX 溶液浓度
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