百脉根WRKY基因家族生物信息学分析_马培杰.pdf

研究报告Research Report百脉根 WRKY 基因家族生物信息学分析马培杰李亚娇舒健虹王小利*贵州省农业科学院草业研究所,贵阳,550006*通信作者,摘要WRKY 转录因子是一个超家族的调节因子，参与植物的多种生物过程和逆境胁迫反应。然而，在百脉根中对 WRKY 家族还没有相关的研究。本研究共鉴定出 79 个 LjWRKYs 基因，它们不均匀分布在各染色体上的基因位点编码，与拟南芥 AtWRKYs 进行系统发育分析，分为 I、II 和 III 类。保守基序和外显子-内含子数目表明 79 个 LjWRKYs 在不同亚簇中均具有较大的差异，顺式作用元件结果显示在上游 2 000 bp 启动子区域包含多种逆境胁迫、激素和生长发育相关的元件。共线性结果有 36 对片段复制和 1 对串联重复复制共线性基因，且 Ka/Ks 均小于 1。本研究通过分析百脉根 WRKY 基因家族的基本结构与性质，为深入研究百脉根 WRKY 基因家族提供了基础。关键词百脉根;WRKY;基因家族Bioinformatics Analysis of WRKY Gene Family in the Lotus corniculatusMa PeijieLi YajiaoShu JianhongWang Xiaoli*Institute of Prataculture,Guizhou Academy of Agricultural Sciences,Guiyang,550006*Corresponding author,DOI:10.13271/j.mpb.021.004606AbstractWRKYtranscription factors are a superfamilyofregulatoryfactors involved in a varietyofplant biologi-cal processes and stress responses.However,there is no research on WRKY family in Lotus corniculatus L.A totalof 79 LjWRKYs genes were identified in this study.They were encoded by loci unevenly distributed on each chro-mosome.Phylogenetic analysis was conducted with AtWRKys in Arabidopsis thaliana,and theywere divided into I,II and III categories.The results of conserved motifs and exon intron numbers showed that 79 LjWRKYs were dif-ferent in different sub clusters.Cis acting elements showed that the upstream 2 000 bp promoter region contained avariety of stress,hormone and growth related elements.The results showed that there were 36 pairs of fragmentreplication and 1 pair of tandem repeats,and the Ka/Ks were less than 1.In this study,the basic structure and prop-erties of WRKY gene family were analyzed,which provided the basis for further study of WRKY gene family.KeywordsLotus corniculatus;WRKY;Gene family基金项目：本研究由贵州省重点基金项目(黔科合基础 2019 1449 号)、贵州省农业科学院青年基金项目(黔农科院青年基金2019 23 号)、贵州省创新人才团队项目(黔科合平台人才 2020 5005)和贵州省高层次创新型人才培养项目(黔科合平台人才2018 5634)共同资助引用格式：Ma P.J.,Li Y.J.,Shu J.H.,and Wang X.L.,2023,Bioinformatics analysis of WRKY gene family in the Lotus corniculatus,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding),21(14):4606-4617.(马培杰,李亚娇,舒健虹,王小利,2023,百脉根 WRKY 基因家族生物信息学分析,分子植物育种,21(14):4606-4617.)百脉根(Lotus corniculatus)又名五叶草、牛角花，属多年生草本植物，性喜温暖潮湿气候，具有营养丰富、适口性好等优点，同时也是优质的水土保持植物(闫向忠,2007;杨芳等,2020)，百脉根野生种广泛分布在贵州各地。但是，百脉根在自然生长条件下经常会遭受各种不利环境和逆境胁迫，影响其生长发育，严重甚至造成植株死亡(李鸿雁等,2020)。植物生长发育经常会遭受生物胁迫和非生物胁分子植物育种，2023 年，第 21 卷，第 14 期，第 4606-4617 页Molecular Plant Breeding,2023,Vol.21,No.14,4606-4617迫逆境胁迫，影响各组织部位的形态建成和体内的生理生化反应(李鸿雁等,2020)。转录因子(Transcrip-tional factors)可与顺式元件结合或与其他调控因子相互作用，调控下游防御相关基因的表达(Lietal.,2015)。许多研究表明，转录因子在植物逆境响应中发挥着重要的调控作用，包括 bHLH(Jinetal.,2016)、MYB(Guoet al.,2017)、bZIP(Ji et al.,2018)和 WRKY(Tang etal.,2014)等。WRKY 蛋白是最大的转录因子家族之一，具有复杂的生物学功能，从单细胞藻类到高等植物等多种植物具有特异性。例如，在拟南芥中，AtWRKY50的过表达促进了芥子酸衍生物的产生(Hussain et al.,2018)。AtWRKY46、AtWRKY54 和 AtWRKY70 在激活油菜素甾醇介导的基因表达和抑制干旱基因响应方面具有重要作用(Chen et al.,2017)。OsWRKY47 正向调控水稻产量和耐旱性(Rainerietal.,2015)。TaWR-KY33 显著提高了小麦的抗旱性(Heetal.,2016)。Ptr-WRKY18 和 PtrWRKY35 增强了杨树对黑穗病的抗性(Jiangetal.,2017)。WRKY 转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，调控包括胁迫反应在内的多种生物过程(陈丽飞等,2023)。WRKY 蛋白在其 N 端包含一个保守的WRKYGQK 基序，在其 C 端包含一个 60 氨基酸长锌指基序(Zinc finger motif)(Eulgem et al.,2000)。这两个基序对于 WRKY 转录因子与靶基因启动子内的 Wbox 顺式元件(T)TGAC(C/T)的结合至关重要。WRKY蛋白根据WRKY 结构域的数量和锌指基元的类型可分为三类，即 C2H2或 C2HC(Rushtonetal.,2010)。族成员有两个 WRKY 结构域和 C2H2型锌指。族成员只有一个 WRKY 结构域和一个 C2H2锌指基序，根据其 DNA 结合域的序列可进一步分为 5 个亚组(a,b,c,d 和e)，族成员有一个 WRKY 结构域和一个 C2HC 型锌指(Rinerson et al.,2015)。不同物种的全基因组分析发现许多 WRKY 基因,其中小麦(Triticum aestivum)171 个(Ning et al.,2017)，玉米(Zea mays)119 个(Wei et al.,2012)，水稻(Oryza sativa)103 个(Rengasamy et al.,2008)和马铃薯(Solanum tuberosum)79 个(Ishiguro and Nakamura,1994)。因此，本研究旨在对百脉根 WRKY 家族成员进行全基因组分析。从百脉根基因组中共鉴定出 79 个LjWRKYs 蛋白。随后，对其理化性质、保守基序、染色体位置、基因复制、内含子-外显子结构、顺式作用元件、共线性及 Ka/Ks 进行了综合分析。结合拟南芥 WRKY 蛋白构建系统发育树。本研究对百脉根 Lj-WRKYs 基因家族成员进行鉴定分析，为后续百脉根WRKY 基因家族的功能验证及胁迫反应关键基因的挖掘提供参考。1结果与分析1.1百脉根LjWRKY家族成员信息及蛋白理化性质分析从百脉根全基因组中共鉴定得到 79 个 WRKY基因，按照染色体和起始终止位置顺序重命名为LjWRKY1LjWRKY79(表 1)。蛋白质理化性质结果显示，氨基酸数目范围在 137 aa(LjWRKY43)761 aa(LjWRKY11)，分子量范围在 16 145.23 Da(LjWRK-Y43)83 088.08 Da(LjWRKY11)，等电点结果显示有44 个 LjWRKY 成员小于 7，为酸性蛋白质，有 35 个LjWRKY 成员大于 7，为碱性蛋白质。亲疏水性结果均小于 0，表明 75 条 LjWRKY 成员为亲水性蛋白质。亚细胞定位预测结果均在细胞核中(表 1)。1.2百脉根LjWRKY家族成员系统进化树分析百脉根LjWRKY 家族成员系统进化树参考拟南芥 WRKY 基因家族成员亚簇分类划分为、和三个主要亚簇，而亚簇中又可以划分为a、b、c、d 和e 五个小亚簇(图 1)。其中，亚簇中分布 17个 LjWRKY 家族成员，占总数的 21.52%；亚簇中分布 54 个 LjWRKY 家族成员，占总数的 68.35%，a小亚簇中分布 5 个 LjWRKY 家族成员，占总数的9.26%；IIb 小亚簇中分布 11 个 LjWRKY 家族成员，占总数的 20.37%；IIc 小亚簇中分布 21 个 LjWRKY 家族成员，占总数的 38.87%；d 小亚簇中分布 12 个LjWRKY 家族成员，占总数的 22.22%；e 小亚簇中分布 5 个 LjWRKY 家族成员，占总数的 9.26%；亚簇中分布 8 个 LjWRKY 家族成员，占总数的 8.86%。通过系统进化树分析结果显示，在所有亚簇和小亚簇中，在c 亚类群中分布的 LjWRKY 成员最多，这与AtWRKY 蛋白类似，表明c 小亚簇中的 LjWRKY蛋白可能参与了多种生物学功能。1.3百脉根LjWRKY家族成员蛋白保守基序、保守结构域和基因结构分析百脉根79 条 LjWRKY 家族成员蛋白保守基序与系统进化树聚类结果显示，在、和三个亚簇和a、b、c、d 和e 五个小亚簇之间保守基序类型均有差异(图2A)。其中，motif1、motif2 和 motif3 三个保守基序均为 WRKY 类型。亚簇中 17 个 LjWRKY百脉根 WRKY 基因家族生物信息学分析Bioinformatics Analysis of WRKY Gene Family in the Lotus corniculatus4607分子植物育种Molecular Plant Breeding表 1 LjWRKY 家族前 20 个成员信息及蛋白理化性质分析Table 1 Information of the top 20 members of LjWRKY family and analysis of physicochemical properties of proteins基因名称GenenameLjWRKY1LjWRKY2LjWRKY3LjWRKY4LjWRKY5LjWRKY6LjWRKY7LjWRKY8LjWRKY9LjWRKY10LjWRKY11LjWRKY12LjWRKY13LjWRKY14LjWRKY15LjWRKY16LjWRKY17LjWRKY18LjWRKY19LjWRKY20基因 IDGeneIDLj1g0026559.1Lj1g0005011.1Lj1g0008012.1Lj1g0010374.1Lj1g0007939.1Lj1g0014341.1Lj1g0016246.1Lj1g0023943.2Lj1g0017831.1Lj1g0020107.1Lj1g0022040.1Lj1g0007812.1Lj1g0008164.1Lj1g0006214.1Lj1g0014895.1Lj1g0018217.1Lj1g0006971.1Lj1g0020092.1Lj1g0013640.1Lj1g0022656.1染色体Chr.Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1Chr.1起始Start813 0343 791 7064 274 5488 783 09010 615 89319 634 59125 290 54433 992 53634 823 18735 686 68036 532 02336 879 68636 914 09440 075 19041 203 71547 527 48949 897 11350 911 16759 776 22959 817 525终止End814 4703 793 7764 277 8818 791 07610 618 40919 638 08925 292 75933 998 00734 832 76335 694 18336 536 35936 882 16736 915 75340 079 42141 207 19647 529 21949 899 35950 912 50359 779 05459 819 554氨基酸数目(aa)Numberofaminoacids(aa)378289519457368160288519558200761216340302484301293166235187分子量(Da)Molecularweight(Da)42 254.2233 004.4556 665.9850 056.4140 802.2218 563.7231 956.7656 571.6661 833.5723 140.6583 088.0824 400.4836 420.0534 750.2354 054.9732 894.2432 727.5619 134.7326 839.3921 175.15等电点pI5.614.576.638.489.329.467.656.488.518.126.058.225.385.517.619.486.264.919.375.67亲疏水性GRAVY-0.597-0.963-0.681-0.903-0.723-1.071-0.594-0.825-0.542-1.007-0.747-0.776-0.621-0.975-1.002-0.597-0.604-1.258-0.763-0.889亚细胞定位Subcellularlocalization细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus家族成员蛋白保守基序为 motif 1、motif 2、motif 3、motif 4 和 motif 5 五种类型，其中 LjWRKY4、LjWR-KY8、LjWRKY48 和 LjWRKY74 四个蛋白包含 2 个motif2 和 1 个 motif3，LjWRKY15、LjWRKY28、Lj-WRKY35、LjWRKY52、LjWRKY53、LjWRKY70 和 Lj-WRKY71 七个蛋白包含 2 个 Motif1 和 1 个 motif 3，LjWRKY11、LjWRKY26、LjWRKY32、LjWRKY54 和LjWRKY72 五个蛋白包含 motif 1、motif 2 和 motif 34608百脉根 WRKY 基因家族生物信息学分析Bioinformatics Analysis of WRKY Gene Family in the Lotus corniculatus图 1 LjWRKY 和 AtWRKY 家族成员系统进化树注:Bootstrap:用来检验计算的进化树分支可信度,即自展值Figure 1 Phylogenetic trees of LjWRKY and AtWRKY family membersNote:Bootstrap:To test the reliability of the branch of the evolutionary tree三种类型。亚簇中，a 小亚簇对应的 LjWRKY蛋白保守基序类型除了 LjWRKY66 不包含 motif 7，其他的均为 motif 1、motif 2、motif 3 和 motif 7 四种类型；b 小亚簇中 LjWRKY 成员蛋白保守基序为 motif 1、motif 2、motif3、motif6、motif7、motif8 和 motif9 七种类型，LjWRKY24 蛋白不包含 motif 8，LjWRKY3、LjWRKY25、LjWRKY73、LjWRKY75 和 LjWRKY77蛋白保守基序不包含 motif1，而包含 motif 2；c 小亚簇中包含 motif 1、motif 2、motif 3、motif 6 和 motif9 五种保守基序类型，除了 LjWRKY33、LjWRKY50和 LjWRKY61 不包含 motif6，其他所有成员均包含motif3 和 motif6 两种类型保守基序；d 和c 两个小亚簇中除了 LjWRKY42 和 LjWRKY63 其他的 Lj-WRKY 的保守基序均为为 motif2、motif3 和 motif 10三种类型保守基序。亚簇中 LjWRKY 蛋白包含motif 1、motif 2、motif 3、motif 4 和 motif 10 五种类型保守基序，且保守基序保守程度差异较大。百脉根 79 条 LjWRKY 家族成员蛋白保守结构域类型主要为 WRKY、bZIP、PTZ00121、MFS 和 Plant_zn_clust 五种类型保守结构域，其中主要以 WRKY和PTZ00121 两种保守结构域为主(图 2B)。百脉根 79 个 LjWRKY 家族成员基因结构显示均具有外显子-内含子，与系统进化树聚类结果显示(图 2C)，亚簇中 LjWRKY 家族成员外显子个数在46 个，内含子个数在 35 个；亚簇中a、b和c三个小亚簇 LjWRKY 家族成员外显子个数在37 个，内含子个数 26 个，d 和e 两个小亚簇除了 Lj-WRKY63 外显子个数有 4 个，内含子个数有 3 个，其他的 LjWRKY 成员外显子个数均有 3 个，内含子个数均有 2 个；亚簇中所有 LjWRKY 成员外显子个数4609分子植物育种Molecular Plant Breeding图 2 LjWRKY 家族成员蛋白保守基序,保守结构域和外显子-内含子Note:A:LjWRKY 家族成员蛋白保守基序;B:LjWRKY 家族成员蛋白保守结构域;C:LjWRKY 家族成员基因结构Figure 2 Conserved motifs,conserved domains and exon introns of LjWRKY family membersNote:A:The conserved motifs of the members of LjWRKY family;B:The conserved domain of LjWRKY family members;C:Genestructure of LjWRKY family members4610有3 个，内含子个数有 2 个。通过比较发现不同和(a,b 和c)两个亚簇的外显子-内含子数目个数差异较小，保守程度高，(d,e)和两个亚簇的外显子-内含子数目个数差异较小，保守程度高。1.4百脉根LjWRKY家族基因染色体定位分析百脉根 LjWRKY 家族基因分布在 Chr.1Chr.6六条染色体上(图 3)。其中，Chr.1 染色体上分布 23个LjWRKY 基因，占总数的 29.11%；Chr.2 染色体上分布 6 个 LjWRKY 基因，占总数的 7.59%；Chr.3 染色体上分布 11 个 LjWRKY 基因，占总数的 13.92%；Chr.4染色体上分布 16 个 LjWRKY 基因，占总数的20.25%；Chr.5 染色体上分布 13 个 LjWRKY 基因，占总数的16.46%；Chr.6 染色体上分布 10 个 LjWRKY 基因，占总数的 12.66%。1.5百脉根LjWRKY家族顺式作用元件分析百脉根 75 个 LjWRKY 基因上游 2 000 bp 启动子区域注释到多种顺式作用元件类型，除了大量基本的 TATA-box 和 CAAT-box 核心元件及光响应元件，还有各种激素、应对胁迫和调控生长发育的元件。激素相关的元件有生长素反应元件(TGA-element 和AuxRR-core)、脱落酸反应元件(ABRE)、脱落酸反应元件(ABRE)、赤霉素反应元件(TATC-box,P-box 和GARE-motif)和茉莉酸甲酯反应元件(CGTCA-motif图 3 LjWRKY 家族基因染色体定位Figure 3 Chromosomal localization of LjWRKY family genes和 TGACG-motif)5 种类型元件；参与逆境胁迫的元件有防御和应激反应元件(TC-rich repeats)、无氧诱导所必需调节元件(ARE)、低温反应元件(LTR)、MYB结合位点参与干旱诱导(MBS)和缺氧特异性诱导相关元件(GC-motif)5 种类型元件；与生长发育有关的元件有昼夜节律调控元件(Circadian)、玉米醇溶蛋白代谢调节元件(O2-site)、胚乳表达调控元件(GCN4_motif)、分生组织表达相关调控元件(CAT-box)、细胞周期调控元件(MSA-like)和种子特异性调控元件(RY-element)6 种类型。1.6百脉根LjWRKY家族基因共线性及Ka/Ks分析百脉根 79 个 LjWRKY 家族成员共线性分析结果共获得 36 对片段复制(Segmental duplications)和1 对串联重复复制(Tandem duplications)共线性基因对(图 5;表 2)。计算 36 对片段复制和 1 对串联重复复制共线性基因对的 Ka/Ks值，结果显示，LjWRKY14:LjWRKY21、LjWRKY29:LjWRKY41、LjWRKY42:Lj-WRKY58 和 LjWRKY46:LjWRKY59 四对共线性基因对 Ka/Ks 值没有得出，其他 32 对片段复制和 1 对串联重复复制共线性基因对的 Ka/Ks 值均小于 1，进而可以说明百脉根 WRKY 基因家族在进化上受纯化选择压力影响。百脉根与拟南芥(Arabidopsis tha-liana)、大豆(Glycine max(L.)Merr)、绿豆(Vigna radia-ta(Linn.)Wilczek)、水稻(Oryza sativa)和玉米(Zea百脉根 WRKY 基因家族生物信息学分析Bioinformatics Analysis of WRKY Gene Family in the Lotus corniculatus4611分子植物育种Molecular Plant Breeding图 4 LjWRKY 家族成员启动子区顺式作用元件种类和数量Figure 4 Types and numbers of cis-acting elements in promotersof LjWRKY genesmays L.)之间分别有 41、151、55、11 和 4 对共线性基因对(图 6)，表明 WRKY 在单子叶和双子叶植物中具有高度的分离现象。2讨论WRKY 转录因子是植物许多过程的关键调控因子，在模式和非模式植物中，都取得了相当大的研究进展，许多 WRKY 基因有被发现能提高植物抵御逆境胁迫的耐受力(Baillo et al.,2019)。对百脉根全基因组鉴定到 79 个 LjWRKYs 基因，通过对 LjWRKYs 和AtWRKYs 的系统发育分析，将 79 个 LjWRKYs 分为3 个主要亚簇：、(小亚簇 IIa,IIb,IIc,IId 和 IIe)和，亚簇中有 54 个成员，占所有组中比例最大(68.35%)，在其他植物 WRKY 家族中亚簇成员的比例也较高，如拟南芥 58%、柠条 64%(Wan et al.,2018)和木薯 66%(Wei et al.,2016)。保守基序和保守结构域均表明 79 条 LjWRKYs 蛋白包含 WRKY 结构域；外显子-内含子结构表明，在同一亚簇的 LjWRKYs 基因具有相似的外显子-内含子数量，LjWRKYs 基因外显子数为 37 个，内含子数为 26 个，与鹰嘴豆相似(Waqaset al.,2019)。LjWRKYs 分布在 16 染色体上。79 个LjWRKYs 基因的启动子区域显示了多种保守的顺式调控元件，参与多种功能，如非生物和生物胁迫响应(MBS,LTR,ARE,TC-richrepeat 和 GCmotif)和植物激素调控(ABRE,TCA-element,TGA-element、TGACG-motif,CGTCA-element,AuxRR-core和 GARE-motif)。许多介导环境应激和植物激素反应的顺式作用元件的存在表明它们参与了不同的生物学过程。WRKY表达的调控可以通过一个 WRKY TF结合到 W-box或通过另一个 TF 结合到 WRKY 启动子上的不同顺式元件来实现。大量研究发现，基因重复(如串联重复,片段重复和基因组重复)是植物基因组中基因家族扩增的关键力量(De Grassi et al.,2008)。百脉根中 LjWRKYs 基因具有 36 对片段复制和 1 对串联重复复制，这比拟南芥的数量要少，串联复制可能对百脉根中 LjWRKYs基因家族的进化具有重要的作用。百脉根中具有复制关系的基因可能促进其自身的生长发育和低于逆境胁迫的能力。并且 LjWRKYs 共线性基因对的 Ka/Ks比值全部小于 1，说明 LjWRKYs 基因通过纯化选择进行了较强的进化。纯化选择(Ka/Ks 比值1)通常通过进化使有害基因消失，有利于生成功能保守的基因，这表明 WRKY 基因的关键保守序列最终有利于植物的生存和生长。4612百脉根与拟南芥、豆科和大豆(豆科)、水稻和玉米的 WRKY 基因共线性分析结果显示，与大豆的共线性基因有 151 对，与拟南芥和绿豆分别有 41 和 55对，与水稻和玉米分别有 11 和 4 对，说明在双子叶和单子叶植物中 WRKY 基因具有很强的特异性，进化分离程度高。3材料与方法3.1百脉根WRKY家族成员鉴定及蛋白理化性质分析通过 JGI 基因组数据库(https:/phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下载百脉根基因组数据，再通过 Pfam 数据库(http:/pfam.xfam.org/)下载 WRKY 隐图 5 LjWRKY 家族基因共线性Figure 5 Gene collinearity of LjWRKY family马尔科夫模型(Pfam 号:PF03106)。利用 Hmmsearch工具将百脉根基因组蛋白质序列数据与 WRKY 隐马尔科夫模型进行搜索比对(李荣春等,2010)，保存E-value1e-10的蛋白质序列并在 Pfam 数据库与NCBICDD(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)进行保守结构域鉴定，去除不含 WRKY 保守结构域的蛋白质，最终保留 79 条蛋白质序列进行后续分析。通过 Ex-PASy(http:/web.expasy.org/protparam/)对 79 条WR-KY 蛋白质序列进行氨基酸数目、分子量、亲疏水性进行蛋白基本理化性质分析，并利用 WoLFPSORTII(https:/ 79 条蛋白质序列进行亚细胞定位预测(赵慧霞等,2020)。百脉根 WRKY 基因家族生物信息学分析Bioinformatics Analysis of WRKY Gene Family in the Lotus corniculatus4613分子植物育种Molecular Plant Breeding表 2 LjWRKY 片段复制和串联重复复制共线性基因对(部分)Ka/Ks 分析Table 2 Analysis of Ka/Ks in LjWRKY fragment replication and tandem repeat replication collinear gene pairs(partial)基因对名称GenepairnameLjWRKY22:LjWRKY1LjWRKY22:LjWRKY29LjWRKY14:LjWRKY21LjWRKY14:LjWRKY39LjWRKY17:LjWRKY40LjWRKY17:LjWRKY31LjWRKY5:LjWRKY62LjWRKY13:LjWRKY30LjWRKY13:LjWRKY42LjWRKY19:LjWRKY44基因对 IDGenepairIDLj1g0005270.1:Lj1g0026559.1Lj1g0005270.1:Lj3g0020366.1Lj1g0006214.1:Lj1g0019627.1Lj1g0006214.1:Lj3g0008288.1Lj1g0006971.1:Lj3g0024941.1Lj1g0006971.1:Lj3g0026514.1Lj1g0007939.1:Lj5g0025023.1Lj1g0008164.1:Lj3g0005737.1Lj1g0008164.1:Lj4g0017913.1Lj1g0013640.1:Lj4g0019902.1Ka0.612 511 2980.561 439 4280.686 075 0460.421 467 2590.408 018 9810.405 369 460.140 254 9210.246 550 2130.676 217 0850.188 150 446Ks2.110 444 0771.848 940 284Na0.701 921 6821.530 636 9021.716 805 7390.527 894 1270.727 361 2551.572 252 9450.593 393 234Ka/Ks0.290 228 6330.303 654 711Na0.600 447 6990.266 568 1070.236 118 4210.265 687 5950.338 965 2820.430 094 3350.317 075 482复制类型Duplicationstype片段复制Segmentalduplications片段复制Segmentalduplications片段复制Segmentalduplications片段复制Segmentalduplications片段复制Segmentalduplications片段复制Segmentalduplications片段复制Segmentalduplications片段复制Segmentalduplications片段复制Segmentalduplications片段复制Segmentalduplications注:Ka:非同义替换率;Ks:同义替换率;Ka/Ks:选择压力比值;Na:无结果Note:Ka:Non-synonymous substitution rate;Ks:Synonymous substitution rate;Ka/Ks:Selective pressure ratio;Na:No results3.2百脉根WRKY家族成员系统进化树分析通过 UniProt 蛋白数据库(https:/www.uniprot.org/)下载拟南芥对应的 70 条 WRKY 蛋白质序列，并重命名为 AtWRKY1AtWRKY70。利用 MEGA X软件将百脉根(79)与拟南芥(70)的 WRKY 蛋白质序列进行 CluStalW 多序列比对，将比对数据结果采用邻接法(neighbor joining,NJ)和设置 Bootstrap 值1 000(其余参数默认)进行系统进化树构建(毕楚韵等,2021)。3.3百脉根WRKY家族成员蛋白保守基序、保守结构域和基因结构分析通过 MEME 在线工具对百脉根 79 条 WRKY蛋白质序列进行保守基序分析，设置 Motif 个数为10 个(其余参考默认)，再通过 NCBI CDD 工具进行蛋白保守结构域预测，统计百脉根 79 个 WRKY 对应的外显子-内含子数目，最后利用 TBtools 工具将保守基序、保守结构域和外显子-内含子与百脉根WRKY 系统进化树进行聚类分析，并绘制效果图。3.4百脉根WRKY家族成员染色体定位分析通过百脉根 GFF3 基因组信息数据提取 79 个WRKY 成员染色体位置分布信息，利用 TBtools 工具绘制染色体定位分布图。3.5百脉根WRKY家族成员顺式作用元件分析通过百脉根染色体基因组数据提取 79 个 WRKY对应的上游 2000bp 的启动子区域序列，于 Plant CA-RE(http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant-care/html/)进行顺式作用元件注释(Lescot et al.,2002)，将注释结果利用 TBtools 工具绘制相关元件位置分布图。3.6百脉根WRKY家族成员共线性及Ka/Ks分析首先将百脉根基因蛋白质数据进行自我BlastALL比对，利用 Mcscan X 工具获取共线性数据(Wang etal.,2012)，统计片段复制和串联重复复制共线性基因，并利用 Circos 绘制染色体内共线性结果图。使用 Ka-Ks_Calclator 工具计算百脉根 WRKY复制基因的同义4614图 6 百脉根与不同物种间的 WRKY 成员共线性基因分析注:A:百脉根与拟南芥;B:百脉根与大豆;C:百脉根与绿豆;D:百脉根与水稻;E:百脉根与玉米;红色连线为共线性基因;上下横线数字表示染色体名称Figure 6 Collinearly gene analysis of WRKY members between Lotus japonicus and different speciesNote:A:Lotus japonicus and Arabidopsis thaliana;B:Lotus japonicus and Glycine max;C:Lotus japonicus and Vigna radiata;D:Lo-tus ja