高效液相色谱法测定饲料和宠物食品中的L-羟脯氨酸.pdf

第 7 卷第 4 期2023 年 12 月现 代 牧 业MODERN ANIMAL HUSBANDRYVol.7 No.4Dec.2023收稿日期:2023-08-24作者简介:薛 宁(1991),女,河南新乡人。通讯作者:兰尊海(1967),男,陕西汉阴人,高级实验师,学士。高效液相色谱法测定饲料和宠物食品中的 L-羟脯氨酸薛 宁,曹明月,平会梦,兰 剑,许亚楠,厉 敏,兰尊海(河南海瑞正检测技术有限公司,河南 郑州 450001)摘要:建立饲料和宠物食品 L-羟脯氨酸含量的高效液相色谱检测方法。采用 C18 色谱柱(4.6 mm250 mm,5 m),流动相为 0.05 mol/L 醋酸钠缓冲液(含 1%N,N-二甲基甲酰胺)和乙腈溶液(体积比为 80:20),流速为1.0 mL/min,检测波长为 360 nm。结果显示,L-羟脯氨酸在 1.0100.0 g/mL 范围内线性关系良好,线性方程 y=2994.4x+1051.9,R2=0.9998;最低检出限为 2.0 mg/kg,回收率 95.00%100.00%。该方法简单快速、重现性好、精确度高,可作为饲料和宠物食品中 L-羟脯氨酸的质量控制手段。关键词:高效液相色谱法;L-羟脯氨酸;饲料;宠物食品中图分类号:S816 文献标识码:A 文章编号:2096-2975(2023)04-0051-06Determination of L-hydroxyproline in feed and pet feed by high performance liquid chromatographyXUE Ning,CAO Mingyue,PING Huimeng,LAN Jian,XV Yanan,LI Min,LAN Zunhai(Henan Hairuizheng Detection Technology Co.,Ltd.Zhengzhou Henan 450001)Abstract:To establish a high performance liquid chromatography(HPLC)method for the determination of L-hydroxyproline in feed and pet food.The chromatography was performed on a C18 column(4.6 mm250 mm,5 m)with mobile phase of 0.05 mol/L sodium acetate buffer(containing 1%N,N-dimethylformamide)and acetonitrile solution(volume ratio was 80:20)at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was 360 nm.The results showed that L-hydroxyproline had a good linear relationship in the range of 1.0100.0 g/mL,and the linear equation y=2994.4x+1051.9,R2=0.9998;The minimum detection limit was 2.0 mg/kg,and the recoveries were 95.00%100.00%.The method was simple,rapid,reproducible and accurate,and can be used as a quality control method for L-hydroxyproline in feed and pet feed.Key words:High performance liquid chromatography;L-hydroxyproline;feed;pet feed L-羟脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸,在胶原蛋白中的含量约为 13.4%,而在弹性蛋白中几乎15薛 宁,等:高效液相色谱法测定饲料和宠物食品中的 L-羟脯氨酸不存在,并且不会出现在其他蛋白质中。动物胶原水解蛋白是通过对动物毛皮及其制品下脚料等成分进行粗加工得到的水解蛋白质,可用作动物饲料添加剂,属于一种廉价的蛋白质来源。然而,某些非法厂商为了提高乳制品中的蛋白含量并降低生产成本,将廉价的水解动物胶原掺入奶粉中冒充乳清蛋白,不仅影响乳制品口感和风味,还导致乳制品营养价值下降、人体吸收利用率降低,危害消费者的身体健康。考虑到合理利用蛋白质资源及相应风险控制问题,利用羟脯氨酸在胶原蛋白中含量最高的特点,可了解饲料和宠物食品的蛋白质的质量情况1-4。目前 L-羟脯氨酸的测定方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、全自动氨基酸分析仪法等5-15。分光光度法比较传统,且操作比较繁琐,结果也存在一定的误差;氨基酸分析仪法所需的仪器价格昂贵,对人员和环境要求较高,不能广泛使用16-23。作者优化了高效液相色谱法检测 L-羟脯氨酸的水解时间、衍生试剂等测定条件,操作简单快速,成本低,易于推广。1 材料与方法1.1 仪器与试剂1.1.1 主要仪器高效液相色谱仪(Waters 2695,沃特世科技有限公司);电子分析天平(BSA224S,赛多利斯科学仪器有限公司);电热鼓风干燥箱(DHG-9070,上海一恒科学仪器有限公司);数控超声波清洗器(KQ-400KDB,昆山市超声仪器有限公司);高速离心机(3-15,SIGMA(扬州)有限公司);快速混匀器(XK96-A/B,江苏新康医疗器械有限公司)等。1.1.2 主要试剂L-羟脯氨酸标准工作液(纯度99.9%,北京曼哈格生物科技有限公司);乙腈(色谱纯,安徽时联特种溶剂股份有限公司);无水乙酸钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);氢氧化钠(分析纯,佛山西陇化工有限公司);磷酸二氢钾(分析纯,天津市大茂化学试剂厂);N,N-二甲基甲酰胺(高效液相色谱专用,上海泸试精细化学品有限公司);盐酸(优级纯,洛阳昊华化学试剂有限公司);碳酸氢钠(分析纯,天津市德恩化学试剂有限公司);冰乙酸(分析纯,天津市永大化学试剂有限公司);2,4-二硝基氟苯(优级纯,德国赛瓦科技公司);实验用水为蒸馏水、高纯水。1.2 试验方法1.2.1 试剂溶液的配制磷酸盐缓冲液的配制:称取 0.68 g 磷酸二氢钾置于 100 mL 容量瓶中,加入 29.1 mL 氢氧化钠溶液(0.1 mol/L)使其溶解,用水定容至刻度,摇匀,即得。碳酸氢钠溶液(0.5 mol/L)的配制:称取 21.0 g的碳酸氢钠,加入 470 mL 高纯水溶解,抽滤,加30 mL 乙腈,转移至试剂瓶中,4 保存备用。2,4-二硝基氟苯(DNFB)试剂的配制:称取 1 g 2,4-二硝基氟苯(DNFB)于 100 mL 容量瓶中,用乙腈溶解定容,转移至棕色试剂瓶中,4 保存备用。醋酸钠溶液(0.05 mol/L)的配制:称取醋酸钠1.7 g,加入高纯水 400 mL,再加入 N,N-二甲基甲酰胺 5 mL,用 10%冰乙酸酸调至 pH 6.4,0.45 m滤膜过滤后备用。流动相的配制:量取400 mL 0.05 mol/L 醋酸钠溶液与 100 mL 乙腈混合,用超声波清洗器进行脱气,即得 0.05 mol/L 醋酸钠缓冲液(含 1%N,N-二甲基甲酰胺,pH=6.4)-乙腈(体积比为 80 20)的流动相。1.2.2 标准溶液和样品溶液前处理L-羟脯氨酸的标准贮备液的配制(1000 g/mL);精密称取 L-羟脯氨酸标准品 100 mg 于 100 mL 棕色的容量瓶中。用 0.1mol/L 的盐酸超声溶解并定容,即为 1000 g/mL 的 L-羟脯氨酸标准溶液的贮备溶液,转移到棕色试剂瓶中于 4 保存。L-羟脯氨酸标准使用溶液的配制:分别量取一定体积的 L-羟脯氨酸标准溶液的贮备溶液,置于50 mL 棕色容量瓶。用0.1 mol/L 盐酸溶液稀释至刻度,依次配制成 1.0 g/mL、5.0 g/mL、20.0 g/mL、50.0 g/mL、100.0 g/mL 的标准工作溶液。样品溶液的制备:准确称取样品 0.31.0 g 于25薛 宁,等:高效液相色谱法测定饲料和宠物食品中的 L-羟脯氨酸50 mL 水解管中,加入 10 mL 盐酸溶液(6 mol/L),于 145 的电热鼓风干燥箱密封水解4 h。放冷,过滤,定容至 50 mL 的容量瓶中,摇匀备用。1.2.3 衍生化反应分别移取 1 mL 标准溶液和样品溶液置于10 mL 试管中,用真空泵抽干,各加入 1 mL 碳酸氢钠溶液(0.5 mol/L),混匀后分别加入 1 mL 2,4-二硝基氟苯-乙腈溶液,混匀后电热鼓风干燥箱中60 衍生 35 min,取出后放至室温,加入磷酸盐缓冲液稀释至刻度,混合后滤过,用于高效液相色谱仪分析。1.2.4 流动相的选择分别选取醋酸钠缓冲液 乙腈(4060)、醋酸钠缓冲液乙腈(60 40)和醋酸钠缓冲液 乙腈(8020)三种不同体积比例的流动相对 L-羟脯氨酸的保留时间和峰型进行对比。1.2.5 色谱条件色谱柱(ODS C18 柱,4.6 mm250 mm,5 m),柱温 30;流动相 0.05 mol/L 乙酸钠缓冲液(含1%N,N-二甲基甲酰胺,pH=6.4)乙腈(8020);流速 1.0 mL/min;检测波长为 360 nm;进样体积10 L。1.2.6 标准曲线的建立分别移取 1.0 g/mL、5.0 g/mL、10.0 g/mL、20.0 g/mL、50.0 g/mL、100.0 g/mL 一系列的标准工作液注入高效液相色谱仪中,以 L-羟脯氨酸浓度值为横坐标,以 L-羟脯氨酸峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。1.2.7 测定按照高效液相色谱仪的操作规程,分别将标准溶液衍生液和样品溶液衍生液各 10 L 注入色谱仪,进行色谱分析。通过分析得到的色谱峰峰面积,计算样品中 L-羟脯氨酸的含量。1.2.8 计算公式X=CVFm10001000100其中,X 为样品中 L-羟脯氨酸的含量(%);C为进样溶液中 L-羟脯氨酸的浓度(g/mL);V 为样品溶液的进样体积(mL);m 为样品的称样量(g)g;F 为样品溶液的稀释倍数。2 结果2.1 前处理条件的优化2.1.1 样品水解时间的选择以含量为 10.05%的 L-羟脯氨酸质控样为参照,对水解时间进行了对比分析,分别设置 2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 等不同的时间段,将各时间段质控样测定结果与理论值进行对比,由表 1 数据可得,水解4 h 结果相对稳定。表 1 不同水解时间的测定结果%时间/h246810结果7.0110.0610.0710.0410.072.1.2 衍生试剂的选择柱前衍生化高效液相色谱法一般采用 C18 键合硅胶为固定相、弱酸盐缓冲液和有机溶剂为流动相,是在选择不同衍生化试剂的基础上建立的方法。作者在选择衍生试剂时比较了邻苯二甲醛(OPA)、丹酰氯(Dansyl-Cl)、6-氨基哇琳基-N-琥珀酰-亚胺基甲酸酯(AQC)和 2,4-二硝基氟苯(DNFB),在考虑试验差和成本的基础上,最终选择的衍生试剂为 2,4-二硝基氟苯(DNFB)。2.2 流动相的选择对比试验结果发现,使用醋酸钠缓冲液-乙腈(8020)作为流动相时,L-羟脯氨酸标准品及样品的保留时间最短,且峰型最为理想。详见图 1 标准溶液色谱图和图 2 样品溶液色谱图。2.3 线性关系考察以 L-羟脯氨酸浓度值为横坐标,L-羟脯氨酸峰面积为纵坐标,如图 3 所示,数据分析处理后得到线性回归方程 y=2994.4x+1051.9,R2=0.9998,结果表明,在 1.0100.0 g/mL 范围内 L-羟脯氨酸溶液浓度和色谱峰面积呈现出良好线性关系。35薛 宁,等:高效液相色谱法测定饲料和宠物食品中的 L-羟脯氨酸图 1 L-羟脯氨酸标准溶液图 2 样品溶液色谱图45薛 宁,等:高效液相色谱法测定饲料和宠物食品中的 L-羟脯氨酸图 3 L-羟脯氨酸标准品的标准曲线2.4 精密度试验选用鸡肉粉、鱼粉、配合料、浓缩料、宠物食品五种不同产品的 L-羟脯氨酸结果进行了重复性测定,测定具体结果见表 2。这五种不同产品的重复性测定结果均不大于 1.80%,说明该方法的准确度较高。表 2 精密度测定结果%次数样品名称 测定数值123456平均值RSD鸡肉粉1.501.561.521.521.501.511.521.47鱼粉0.850.840.850.820.830.820.841.65配合料0.400.390.390.390.400.400.401.39浓缩料0.660.640.650.640.650.640.651.26宠物食品(猫粮)1.061.071.101.081.091.111.091.722.5 检出限试验选取空白样品 6 份,其中 5 份空白样品分别加入不同较低浓度的标准工作溶液,按照步骤处理样品后上机测定,对比不同浓度的信噪比值结果,测定结果见表 3,将引起 3 倍信噪比时的浓度定义为方法检出限,样品为1 g 时,该方法检出限 2.0 mg/kg,方法灵敏度较高。表 3 不同浓度的信噪比值空白样品添加浓度/(mg/kg)信噪比值/(s/n)100.01020.50.902311.623423.002534.850646.5202.6 回收率试验选取 12 份同一基层样品,分别添加三个不同的标准溶液浓度,依次为3 mg/kg、6 mg/kg、10 mg/kg,按照此方法每个浓度平行测定四次,测定结果如表 4 所示,回收率在 95.00%100.00%之间。RSD 为 1.00 1.75 之 间,表 明 该 方 法 回 收 率较高。3 结论建立了饲料和宠物食品中 L-羟脯氨酸的高效液相色谱测定方法,测得的相对标准偏差在 1.47%1.72%之间,回收率在 95.00%100.00%之间,最低检出限为 2.0 mg/kg,优化后的方法基质干扰较小、灵敏度高、重复性好、准确度高,可为饲料和宠物食品行业的质量控制提供重要支持。55薛 宁,等:高效液相色谱法测定饲料和宠物食品中的 L-羟脯氨酸表 4 回收率的测定结果样品本底值添加标准浓度测值/(mg/kg)回收率/%平均回收率/%RSD7.7596.8837.6095.0097.257.8798.371.757.9098.7510.8999.00610.9899.825.010.8798.8298.701.1210.6997.1814.9999.931015.00100.0014.6897.8798.231.0014.8799.13参考文献:1 侯林丛,李贤,陆静,等.高效液相色谱法测定饲料及宠物食品中牛磺酸J.江西畜牧兽医杂志,2021(02):39-43.2 侯林丛,陆静,梁辰,等.高效液相色谱法测定饲料中喹烯酮J.食品安全质量检测学报,2020,11(18):6.3 王珊.化妆品中性激素高效相色谱检测方法研究D.上海:上海应用技术学院,2015.4 陈文帮,丁作坤,陶小平,等.鸡肉中阿德呋啉的残留检测高效液相色谱法J.南京农业大学学报,2013,36(03):139-142.5 丁在亮.原子荧光法测定饲料中硒的研究D.合肥:安徽农业大学,2013.6 闫俊秀.化妆品中 2 种限用硝基麝香和 4 种禁用亚硝基类物质的检测研究 D.上海:上海应用技术学院,2013.7 吴虹,余林生,檀华蓉,等.高效液相色谱法检测蜂蜜中氟氯苯氰菊酯的残留J.安徽农业大学学报,2013,40(02):4.8 王鹏思,李嘉欣,石上梅,等.GC 法测定市售动物源性中药材地龙、水蛭中 3 种氯霉素类药物的残留量J.中国兽药杂志,2017,51(03):65-69.9 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