蛋白质结构稳定性检测的实验课程设计.pdf

第 41 卷 第 1 期 2024 年 2 月 石玉华 等 蛋白质结构稳定性检测的实验课程设计 167 蛋白质结构稳定性检测的实验课程设计 石玉华 谢鹍鹏 崔 帅 单亚明（吉林大学生命科学学院，吉林长春 130012）摘 要 随着生物技术的突破和发展，多肽蛋白类药物的出现使得人类疾病的诊断和治疗发生了翻天覆地的变化。为了顺应多肽蛋白类药物的飞速发展，加强生命科学等专业本科生对此类药物制剂相关知识的普及已势在必行。此实验课程设计利用稳定性热检测法分析蛋白质结构的稳定性，为生命科学等专业本科生设计一堂深入了解蛋白质结构与功能关系的课程，以促进本科生拓宽学术视野，提升完成相关科学研究和适应医药产业发展新形势的能力。关键词 多肽蛋白类药物；蛋白质结构与功能；蛋白质结构稳定性；实验课程设计；生命科学专业 中图分类号 Q-337 文献标识码 A Design of the experimental course for thermostability determination of protein Shi Yuhua;Xie Kunpeng;Cui Shuai;Shan Yaming(School of Life Sciences,Jilin University,Changchun 130012,China)Abstract In the face of breakthroughs and advancements in biotechnology,the advent of polypeptide protein drugs has catalyzed a profound transformation in the diagnosis and treatment of human diseases.As these polypeptide protein drugs evolve rapidly,it is becoming increasingly essential to bolster knowledge related to these drug among undergraduate students,particularly those majoring in life sciences and associated fields.To cater to this need,we have architected a unique experimental course that incorporates heat stability testing of purified proteins or peptides as a central research topic.This experimental course is designed to utilize thermal stability assays for the analysis of protein structure stability,and is tailored for undergraduate students in life sciences and related majors.The course aims to provide an in-depth understanding of the relationship between protein structure and function,in order to broaden the academic horizons of undergraduate students,and enhance their capabilities in conducting relevant scientific research and adapting to the evolving trends in the pharmaceutical industry.Key words Polypeptide protein drugs;Protein structure and function;Protein structural stability;Experimental course design;Life science major 蛋白或多肽类药物是以氨基酸为基本单位，构成的具有预防或治疗疾病作用的蛋白质或多肽片段。这类药物目前已被看作 21 世纪药物研发的重点研究方向之一，在人类疾病治疗中具有广阔前景1-3。与传统药物相比，蛋白或多肽类药物具有用量小，效果显著、特异性好等优点，但同时也存在结构稳定性差、贮存条件苛刻、易被降解等缺点4-7。虽然这类药物在医药行业中扮演着重要角色，但若要真正实现其治疗效果的最大化，则必须确保药物中蛋白或多肽结构稳定性。蛋白或多肽的结构稳定性是指其在体外非自然条件下（温度、pH 值、溶剂和盐浓度等不利条件）收稿日期：2023-05-04 基金项目：吉林省科学技术厅资助项目（20220204008YY）作者简介：石玉华（1973），女，长春，硕士，高级工程师，主要研究方向为微生物与免疫学， Modern Scientific Instruments Vol.41 No.1 Feb.2024 168 抵抗不可逆结构变化的能力。对于蛋白或多肽而言，其在保存、使用过程中任何条件的改变都会导致蛋白结构变化，使药效失活，造成不可挽回的后果与损失。所以如何实现快速检测，并探究最适贮存条件就变得尤为重要，这也是未来生物行业进一步发展所面临的问题。但是，目前许多大学相关专业的人才培养并不能满足生物与医药行业所需人才的空缺。为了满足此类生物制品设计中日益增长的速度和竞争的需要，同时为生物行业输送更多所需要的人才，加强学生对于蛋白或多肽的结构稳定性充分掌握和理解，有必要在生命科学等专业学生培养过程中通过一堂生动有趣的实验课程，提高相关专业的学生对于蛋白结构与功能更深层次的理解。其中，蛋白或多肽的结构稳定性是药物质量的重要指标之一，由于药物的用量小且十分昂贵，结构的改变不易被发现，如何实现其结构的微观且快速测定就变得尤为重要9-12。常规的 X 线晶体衍射法、核磁共振技术等，这些都是基于不同机理鉴定化合物结构的有效方法。但这些传统方法耗力费时，并且存在可重复性差，实验方法不稳定等缺点，珍贵的样品长时间暴露于室温进行测试也会带来损失和实验误差。如果应用上述的方法来进行生物化学实验设计，长时间的实验不仅会引起学生学习兴趣的丢失，也会造成学生注意力难以集中的问题。在这样的背景下，稳定性热分析法可辅助解决上述问题，实现快速检测蛋白或多肽品质，有效减少实验所需时间，激发学生的学习兴趣。稳定性热分析法是指由于蛋白或多肽的天然结构会随着温度的变化而去折叠，使其内部的氨基酸残基逐渐暴露出来，引起部分氨基酸残基（色氨酸/酪氨酸）荧光发射特性的变化，导致体系荧光信号强度上升13-15。蛋白质稳定性热分析仪可以在系统升温过程中（温控范围3595，升温速率 30/min）检测并记录蛋白质内部色氨酸和酪氨酸残基在350 nm和330 nm波长的荧光信号变化，反映蛋白结构的转变过程。通过参考变化过程中的信号参数，比较和验证蛋白质的结构稳定性及品质，积累功能蛋白质的特征谱图，获得稳定性热分析参数。例如，乔永波等就曾利用稳定性热分析法监测纯化的蛋白质与储存 6 个月的蛋白质间的差异16。图 1 温度与蛋白结构的变化 鉴于稳定性热分析法在蛋白样品检测中的重要地位和省时省力的特点，可尝试使用其作为蛋白质结构稳定性的检测手段，为生命科学等相关专业本科学生设计一堂快速鉴定蛋白质类药物质量的实验课程。本文利用蛋白质稳定性热分析仪评价工程菌表达纯化后的酪蛋白在不同 pH，以及储存温度下蛋白结构的变化，收集特征谱图，获得稳定性热分析参数，探索保持蛋白质热稳定性的最佳条件。1 实验部分 1.1 实验仪器与样品（1）诺坦普 Tycho NT.6 分析仪（Nanotemper，德国诺坦普公司）；（2）诺坦普 Tycho NT.6 高精度玻璃毛细管（Nanotemper，德国诺坦普公司）；（3）酸度计（PHS-3E，上海仪电科学仪器股份有限公司）；（4）-酪蛋白（实验室制备）；（5）磷酸盐缓冲液 PBS（实验室配制）；（6）Tris 缓冲溶液 TBS（实验室配制）；（7）0.1mol/L 盐酸；1.2 样品准备与试剂配制 10PBS：称取 80g NaCl，2g KCl，36.3g Na2HPO412H2O，2.4g KH2PO4，去离子水定容到 1 L，使用时稀释到 1，然后用 0.1mol/L 盐酸进行 pH的调节，作为蛋白样品的缓冲液。第 41 卷 第 1 期 2024 年 2 月 石玉华 等 蛋白质结构稳定性检测的实验课程设计 1691TBS：称取 3g Tris，8g NaCl，去离子水定容到 1L。使用时将 pH 调节到 7.4，作为纯化蛋白的缓冲液。酪蛋白：酪蛋白约占牛奶总蛋白质的 80%，是牛乳中重要的蛋白质之一。本研究通过构建特定酪蛋白表达系统，由大肠杆菌（E.coli）原核表达，经His-Tag 亲和柱纯化后获得酪蛋白。1.3 实验条件的选择（1）pH 对蛋白质结构稳定性的影响 1 PBS 作为蛋白质的储存体系，本实验在 3 种不同的 pH 环境下进行，具体如下表。表 1 pH 对蛋白质结构的影响 实验处理 样品 1 样品 2 样品 3 酪蛋白/（mg/L）pH 30 6 30 7.4 30 8.8（2）温度对蛋白质结构稳定性的影响 将纯化的蛋白样品加入到相同体积且 pH 一致的PBS 中，分别置于-80、4 以及室温下保存 7 天，具体如下表。表 2 温度对蛋白质结构的影响 实验处理 样品 1 样品 2 样品 3 酪蛋白/（mg/L）温度/30-80 30 4 30 22 1.3 预实验 通过设置酸性，中性和碱性三种梯度，进行蛋白结构稳定最适 pH 的大致探索。本次探究设置 pH3、7 和 9。摸索蛋白质结构稳定的 pH 范围。过酸或过碱条件下都会使蛋白结构发生改变。最适温度的选择根据实验室常用保存蛋白的条件来进行设置。1.4 实验实施 由于实验室之前已经成功构建酪蛋白表达系统，将收集好的蛋白样品来进行纯化，教师指导下，学生可独立进行蛋白纯化系统的使用。通过该实验课程，学生能深入了解蛋白质的制备、纯化以及结构的初步表征。将纯化后的蛋白分装成7个试管取其中1支试管作为标准样品，取 3 支试管用于 pH 测试，另外 3 支试管分别置于不同温度条件下进行保存，一周后进行温度实验探究。蛋白样品按照以下步骤进行检测：（1）打开系统门。（2）打开毛细管托盘的磁盖。（3）实验前用 99.8%乙醇清洁毛细管托盘的反射表面。保持托盘表面无灰尘，污垢和划痕。（4）将毛细管浸泡到样品中，直到样品完全填充毛细管。注意不要触碰毛细管的中段部分。（5）将毛细管竖直放置在毛细管托盘上。（6）推上毛细管托盘的磁盖。（7）关上系统门，点击触屏按键，开始测量。2 实验数据处理 测量结束后，调出样品的数据图。测量数据记录了样品蛋白质荧光信号强度随温度变化而发生的改变，荧光信号强度的变化如下图所示。图 2：荧光信号强度变化情况 依据330 nm与350 nm记录的荧光比值数据进行分析拐点温度（Ti）值和 Ratio 值：（1）Ti 值：蛋白质去折叠 50的温度被称为 Ti值，350 nm 与 330 nm 的比值可用来计算 Ti 值。如果一个蛋白质检测到多个 Ti 值，这意味着该蛋白质有多个结构域。（2）Ratio 值：在检测过程中，330 nm 和 350 nm的比值称为 Ratio 值。在 35与 95处 Ratio 值的差（Ratio 值）可以用作衡量蛋白质结构的指标。不同批次的同一种蛋白质，较大的Ratio 值表明蛋白结构稳定性较高；相反，较小的Ratio 值表明蛋白结构稳定性较低。根据上述两种主要的参数 Ti 值和Ratio 值进行量化分析并与标准蛋白的参数进行比较，可以确定所 Modern Scientific Instruments Vol.41 No.1 Feb.2024 170 测蛋白质结构的完整性，最佳保存温度及其最适 pH。3 教学实践过程与讨论 本实验项目是一项学科交叉的综合性实验，对培养学生实践创新能力具有重要作用。本实验课程授课对象可以针对生命科学等相关专业本科二年级学生。计划开展实验课程两次，覆盖学生人数 40 人，每五个人为一组。在实验开始前，教师向学生讲授蛋白质结构与功能的关系，即正确的蛋白质折叠结构是蛋白质发挥其生物学功能的关键，反之，变性后的蛋白质会失去活性并丧失功能。根据事先发放的仪器使用步骤，学生可独立进行仪器的使用，教师在旁指导。在“蛋白质结构稳定性测试”实验操作过程中，教师要及时指导学生做好相关实验结果的记录工作，学生通过记录实验数据不仅能对蛋白制备过程及检测加深记忆，还可以及时对实验结果是否准确与他人进行对比。探究蛋白质结构稳定性的实验课程活动，可事先根据学生的分组数发放实验指导，让学生可以进行充分的预习及实验资料的收集。在实验开始前，要根据学生分组数进行实验器材的布置，既可以节省大量时间又可以规范学生操作，防止实验器材的乱用。在教师的指导下，小组完成样品的准备后，统一检测，学生要及时做好实验数据记录工作。本次实验设计面向生命科学等相关专业本科学生，对于学生掌握和理解生物化学中蛋白质相互作用、蛋白类药物的结构稳定性以及制药相关专业对于药品品质评价具有较好支撑。通过对蛋白质结构稳定性的探究实验教学，加深生命科学等相关专业本科学生对蛋白类药物研究知识的认知，更好地掌握蛋白类药物的相关知识。4 结语 快速检测无染料标记的蛋白质样品高级结构的稳定性，在生命科学等相关专业领域逐渐崭露头角。蛋白质稳定性热分析仪可以整合全部的蛋白结构品质信息，节省大量的实验空间。同时，无需透析或样品稀释，可在宽广的浓度范围，及任意缓冲液中进行蛋白评价。本实验课程设计评价蛋白质高级结构所需样品体积仅约为 10 L，可有效节约下游实验参数测定的时间，并在几分钟内快速获得数据。实验结束后，能够轻松便捷地导出原始数据、自动分析结果及总结报告图。稳定性热分析法非常适合在实验课程上展示蛋白质高级结构与功能的关系。在生物化学教学、科研及商业应用中，基于稳定性热分析的方法检测蛋白质结构、生物制剂（如抗体）的结构稳定性，可获得防止蛋白质降解的条件，避免由于蛋白降解所造成的损失。整个过程快速简单，步骤清楚，缺点是毛细管较为脆弱，易于损坏需要小心操作。通过本次实验设计可以加强学生的动手操作能力，以及对于蛋白类药物相关知识更深层次的理解，对于 21 世纪医药行业人才的培养与输送也具有重要意义。参考文献 1 孙钰芳,宗辉,郭诗雨等.重组 Fc 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