GRSF1_GPX4轴调控的铁代谢紊乱在小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用.pdf
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1、基金项目:国家自然科学基金资助项目(82102295)作者单位:430060武汉大学人民医院麻醉科通信作者:刘恋,电子信箱:elysiall GRSF1/GPX4 轴调控的铁代谢紊乱在小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用刘雅静李亚男李冰玉王苏刘恋摘要目的探讨 GRSF1/GPX4 轴调控的铁代谢紊乱在小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。方法清洁级雄性 C57BL/6小鼠 18 只,采用随机数字表法将其分为假手术组、脑缺血再灌注组、脑缺血再灌注+GRSF1 过表达组,每组各 6 只。脑缺血再灌注组采用线栓法制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型;脑缺血再灌注+GRSF1 过表达组于造模前 7 天注射 GRSF1 过表达
2、慢病毒。再灌注 24h 后行神经功能评分,TUNEL 法检测细胞凋亡率,Western blot 法检测 GRSF1、GPX4、IRP2、TfR1 和铁蛋白表达水平。结果与假手术组比较,脑缺血再灌注组神经功能评分、凋亡率、IRP2、TfR1、铁蛋白表达水平升高,GRSF1、GPX4 表达水平降低(P 0.05);与脑缺血再灌注组比较,脑缺血再灌注+GRSF1 过表达组神经功能评分、凋亡率、IRP2、TfR1、铁蛋白表达水平降低,GRSF1、GPX4 表达水平升高(P 0.05)。结论过表达 GRSF1 通过上调 GPX4 抑制铁离子代谢紊乱进而减轻小鼠脑缺血再灌注损伤。关键词GRSF1GPX4
3、铁代谢脑缺血再灌注损伤中图分类号R614文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2024.03.008Role of Iron Metabolism Disorder Regulated by GRSF1/GPX4 Axis in Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in mice.LIU Yajing,LIYanan,LI Bingyu,et al.Department of Anesthesiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Hubei 430060,ChinaAbstr
4、actObjectiveTo investigate the role of iron metabolism disorder regulated by GRSF1/GPX4 axis in cerebral ischemia-reperfusion injury in mice.MethodsA total of 18 clean grade male C57BL/6mice were randomly divided into 3groups:sham operationgroup,cerebral ischemia-reperfusion group,cerebral ischemia-
5、reperfusion+GRSF1 overexpression group,with 6mice in each group.The model of cerebral ischemia-reperfusion was established by thread occlusion in cerebral ischemia-reperfusion group,and GRSF1overexpressed lentivirus was injected in cerebral ischemia-reperfusion+GRSF1 overexpression group 7days befor
6、e modeling.After 24h ofreperfusion,the neurological function score was evaluated,apoptosis rate of brain tissue was detected by TUNEL method,and the proteinexpression levels of GRSF1,GPX4,IRP2,TfR1 and ferritin were detected by Western blotting method.ResultsCompared with shamoperation group,the neu
7、rological function score,apoptosis rate were increased as well as the expression levels of IRP2,TfR1 and ferritinin cerebral ischemia-reperfusion group,while GRSF1,GPX4 expression levels were decreased(P 0.05).Compared with cerebral is-chemia-reperfusion group,the neurological function score,apoptos
8、is rate,the expression levels of IRP2,TfR1 and ferritin were de-creased in cerebral ischemia-reperfusion+GRSF1 overexpression group,while GRSF1 and GPX4 expression levels were increased(P 0.05).ConclusionOverexpression of GRSF1 attenuates cerebral ischemia-reperfusion injury in mice by up-regulating
9、 GPX4 to in-hibit iron metabolism disorder.Key wordsGRSF1;GPX4;Iron metabolism;Cerebral ischemia-reperfusion injury铁作为机体必不可少的微量元素之一,对生命活动具有十分重要的意义。适量铁离子可参与细胞能量代谢,而过多的铁离子又可抑制机体自我修复功能进而启动铁死亡加重损伤1。研究证实,细胞对铁稳态有着严格的调控机制却没有适当的清除机制,机体中铁的储存量增多,可引起氧化还原失衡,最终导致组织向不可逆的细胞死亡方向进展2。已有研究证实,铁离子是神经元损伤和死亡的关键调节因子,缺血脑组织中
10、铁代谢相关蛋白发生改变会导致铁离子聚集,而过量的铁离子可通过芬顿反应催化生成大量羟自由基,诱导细胞损伤,加重急性缺血期受损组织的损害并减少再灌注带来的有益效果3,4。研究发现富含鸟嘌呤序列的结合因子 1(guanine-rich sequence-binding factor 1,GRSF1)在胚胎发育过程中可上调磷脂谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione43论著J Med Res,March 2024,Vol.53 No.3peroxidase 4,GPX4)的表达进而促进脑发育,而 GPX4作为抑制铁死 亡的重要 因 子,有 报 道 称 其 可 通 过GRSF1/GPX4 轴抑制铁离子
11、的聚集、改善心肌氧化应激进而减轻损伤5,6。然而 GRSF1/GPX4 轴是否可以通过调控铁代谢进而改善脑缺血再灌注损伤(cer-ebral ischemia reperfusion injury,CIRI)目前尚未见相关报道。本研究旨在探讨 GRSF1/GPX4 轴调控的铁代谢紊乱在 CIRI 中的作用,以期为改善 CIRI 的预后提供新思路。材料与方法1.实验动物及分组:清洁级健康雄性 C57BL/6小鼠 18 只,湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,动物许可证号:SYXK(湘)2019-0004。本研究已获得笔者医院动物实验伦理委员会审批伦理学审批号:WDRM 动(福)第 2020030
12、3 号。随机分为假手术组、脑缺血再灌注组、脑缺血再灌注+GRSF1 过表达组。脑缺血再灌注组及脑缺血再灌注+GRSF1 过表达组采用线栓法制备小鼠大脑中动脉栓塞模型,缺血 60min 再灌注 24h;脑缺血再灌注+GRSF1 过表达组造模前 7 天予以脑组织内注射 GRSF1 过表达慢病毒(上海吉凯基因医学科技股份有限公司)。2.主要材料:BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司;GRSF1 抗体(货号:A18227)、GPX4 抗体(货号:A1933)、TfR1 抗体(货号:A5865)购自武汉爱博泰克生物科技有限公司,IRP2 抗体(货号:23829-1-AP)、铁蛋白
13、抗体(货号:10727-1-AP)购自武汉三鹰生物技术有限公司,-actin 抗体(货号:GB11001)购自武汉赛维尔生物科技有限公司。3.脑室注射慢病毒:0.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠,固定小鼠头部于鼠脑立体定位架,消毒后沿头部正中线切皮暴露头骨。参考课题组既往研究进行定位后用微量注射泵垂直颅骨刺入,向小鼠侧脑室缓慢注射 2l 的 GRSF1 过表达慢病毒悬液。4.动物模型制备:麻醉小鼠后在小鼠颈部垫枕仰卧位固定,消毒后于颈部正中切口,显微镜下暴露并分离左侧颈总动脉及颈外动脉分支,分别结扎颈总动脉近心端及颈外动脉,利用动脉夹夹闭颈总动脉远心端阻断血流,尽可能靠近颈总动脉结扎处剪一小口,
14、插入线栓通过动脉分叉处继续向前推进,稍感阻力则停止,固定线栓并缝合切口。线栓置入 60min 后拔出恢复灌注。再灌注 24h 后行神经功能评分,小鼠不能自主活动或死亡记 4 分,行走时向对侧倾倒记 3 分,向对侧转圈记 2 分,提尾时对侧前肢不能伸直记 1分,无异常记 0 分。5.TUNEL 法检测细胞凋亡:4%多聚甲醛固定24h,脱水包埋后切片,脱蜡水化,滴加蛋白酶 K 工作液,37 水 浴 锅 孵 育 30min,随 后 破 膜 室 温 孵 育10min,浸入 TUNEL 混合液 37 孵育 60min,PBS 漂洗后滴加 DAPI 染液,室温避光孵育,最后用抗荧光淬灭封片剂封片,显微镜下
15、观察拍照,使用 Image J 软件进行定量分析。6.Western blot 法检测 GRSF1、GPX4、铁调节蛋白(iron regulatory protein 2,IRP2)、转铁蛋白受体 1(transferrin receptor 1,TfR1)、铁蛋白:根据样品顺序依次上样,电泳仪恒压 80V 30min,观察溴酚蓝通过浓缩胶后调整为恒压 120V 继续电泳至溴酚蓝将到底部。PVDF 膜 经 甲 醇 激 活,电 转 仪 恒 流 200mA120min 进行转膜,快速封闭液封闭后 TBST 洗膜 1次,随后一抗孵育 4 过夜,TBST 洗涤,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗孵
16、育 1h,TBST 洗涤后使用 ECL 显影液避光孵育及利用显影仪显影,利用Image J 软件进行灰度值分析。7.统计学方法:应用 GraphPad Prism 8.0 统计学软件对数据进行统计分析,符合正态分布的计量资料以均数 标准差(x s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用 Turkey 检验,以 P 0.05 为差异有统计学意义。结果1.小鼠神经功能评分和凋亡率的比较:与假手术组比较,脑缺血再灌注组小鼠神经功能评分升高,大脑皮质缺血半暗带区神经元凋亡率升高(P 0.05);与脑缺血再灌注组比较,脑缺血再灌注+GRSF1 过表达组神经功能评分减小,各区域神经元凋亡率降低(P
17、 0.05),详见表 1、图 1。表 1小鼠神经功能评分及神经元凋亡率的比较(x s)组别神经功能评分(分)凋亡率(%)假手术组0.000 0.00010.194 1.564脑缺血再灌注组2.667 0.47140.222 3.823脑缺血再灌注+GRSF1 过表达组1.500 0.500#23.936 2.591#与假手术组比较,P 0.05;与脑缺血再灌注组比较,#P 0.052.小鼠 GRSF1/GPX4 轴的表达变化:与假手术组比 较,脑 缺 血 再 灌 注 组 小 鼠 GRSF1、GPX4 降 低(P 0.05);与脑缺血再灌注组比较,脑缺血再灌注+GRSF1 过表达组 GRSF1、
18、GPX4 升高(P 0.05),详见表 2、图 2。53医学研究杂志 2024 年 3 月第 53 卷第 3 期论著图 1TUNEL 染色观察各组神经元凋亡情况表 2小鼠 GRSF1/GPX4 轴的表达变化(x s)组别GRSF1GPX4假手术组1.000 0.0001.000 0.000脑缺血再灌注组0.528 0.0520.557 0.042脑缺血再灌注+GRSF1 过表达组0.872 0.030#0.819 0.031#与假手术组比较,P 0.05;与脑缺血再灌注组比较,#P 0.05 3.小鼠铁代谢水平的表达变化:与假手术组比较,脑缺血再 灌注组小鼠 IRP2、TfR1、铁蛋白升高(P
19、 0.05);与脑缺血再灌注组比较,脑缺血再灌注+GRSF1 过表达组 IRP2、TfR1、铁蛋白降低(P 0.05),详见表 3、图 3。图 2小鼠 GRSF1/GPX4 轴的表达变化及 Western blot 法条带图表 3小鼠铁代谢水平的变化比较(x s)组别IRP2TfR1铁蛋白假手术组1.000 0.0001.000 0.0001.000 0.000脑缺血再灌注组1.385 0.0741.498 0.0601.509 0.113脑缺血再灌注+GRSF1 过表达组1.096 0.037#1.081 0.056#1.283 0.091#与假手术组比较,P 0.05;与脑缺血再灌注组比较
20、,#P 0.05讨论大脑中铁代谢缓慢,铁离子在中枢神经系统中的累积远超其他组织,因此深入探究铁代谢及其涉及的信号通路在神经系统疾病中的发病机制具有重要价值。研究证实铁离子增加可触发氧化应激损伤和炎性介质的积累进而导致大脑长期处于应激与炎性状态,加剧细胞发生死亡的风险7。近年来有研究指出,即使是正常周龄的小鼠发生脑缺血再灌注损伤后也会出现衰老细胞增多,铁离子蓄积的现象8。而作为机体内重要的抗衰老因子,研究发现,GRSF1 沉默后细胞内铁离子及 TfR1 表达增加,GPX4 表达下降6。因此有研究认为,GRSF1 耗竭诱导的铁代谢紊乱可能是脑缺血再灌注损伤的关键机制之一。63论著J Med Res
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