百香果皮多糖对环磷酰胺诱导的雏鸡免疫抑制的调节作用.pdf

第 7 卷第 3 期2023 年 9 月现 代 牧 业MODERN ANIMAL HUSBANDRYVol.7 No.3Sep.2023收稿日期:2023-03-01基金项目:广西重点研发计划(桂科 AB19245037)。作者简介:杨蒙蒙(1991),女,河南周口人,硕士生。通讯作者:司红彬(1977),男,河南商丘人,教授,博士。百香果皮多糖对环磷酰胺诱导的雏鸡免疫抑制的调节作用杨蒙蒙,李裕鑫,周聪聪,张 苑,张丽芳,司红彬(广西大学 动物科学技术学院,广西 南宁 530004)摘要:研究百香果皮多糖对环磷酰胺诱导的雏鸡免疫抑制的调节作用。选用 160 只 7 日龄健康雏鸡,随机分为对照组、模型组、黄芪多糖组、百香果皮多糖组。在 14、28 日龄进行新城疫免疫;在 29、31、33 日龄,除对照组外,其余各组注射 60 mg/kg 环磷酰胺,建立免疫抑制模型。采集样品后,分别测定各组雏鸡的新城疫抗体效价、血清中免疫球蛋白和细胞因子含量、免疫器官指数、肠道指标等。结果显示,模型组雏鸡免疫器官指数极显著缩小(P0.001),35 日龄、42 日龄雏鸡 HI 抗体水平极显著降低(P0.01);血清中 IgG、IgM、TNF-、INF-、IL-4、IL-10、IL-1、IL-6 含量极显著下降(P0.01);肠道绒毛断裂萎缩、变粗;隐窝数量、杯状细胞数量、绒隐比值极显著减少(P0.01)。百香果皮多糖组雏鸡免疫器官指数有上升趋势,35 日龄、42 日龄雏鸡 HI 抗体水平显著升高(P0.05);血清中细胞因子含量显著或极显著升高(P0.05 或 P0.01);肠道绒毛较长,且隐窝较浅,隐窝数量、杯状细胞数量、绒隐比值显著增多(P0.05)。百香果皮多糖对环磷酰胺造成的免疫功能降低有提升作用,对环磷酰胺造成的肠道损伤有缓解作用。关键词:百香果皮多糖;环磷酰胺;免疫调节;肠道屏障中图分类号:S831.5 文献标识码:A 文章编号:2096-2975(2023)03-0001-07Modulatory effect of polysaccharide from passion fruit peel on cyclophosphamide-induced immunosuppression in chickenYANG Mengmeng,LI Yvxin,ZHOU Congcong,ZHANG Yuan,ZHANG Lifang,SI Hongbin(College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning Guangxi,530004)Abstract:To study the regulation effect of polysaccharide from passion fruit peel on immunosuppression induced by cyclophosphamide in chicken.A total of 160 7-day-old healthy chicken were randomly divided into control group,model group,astragalus polysaccharide group and passion fruit peel polysaccharide group.Newcastle disease immunization at 14 and 28 days of age;at 29,31 and 33 days of age,except the control group,the other groups were injected with 60 mg/kg cyclophosphamide to establish an immunosuppressive model.After sample collection,Newcastle disease antibody titer,serum immunoglobulin and cytokine contents,immune organ index and intestinal index of chickens in each group were determined.The results showed that the immune organ index in the model group was significantly reduced(P0.001),and the HI antibody level at 35 days of age and 42 days of age was significantly decreased(P0.01).The contents of IgG,1杨蒙蒙,等:百香果皮多糖对环磷酰胺诱导的雏鸡免疫抑制的调节作用IgM,TNF-,INF-,IL-4,IL-10,IL-1 and IL-6 in serum were significantly decreased(P0.01);Intestinal villi fracture atrophy and thicken;the number of crypts,goblet cells and pile-crypt ratio were significantly decreased(P0.01).The immune organ index of passion fruit polysaccharide group had an increasing trend,and the HI antibody level of 35 and 42 days of age was significantly increased(P0.05);Serum cytokine content was significantly increased(P0.05 or P0.01);the intestinal villi were longer and the crypts were shallower,and the number of crypts,goblet cells and the ratio of pile-crypt were significantly increased(P0.05).The polysaccharide of passion fruit peel can enhance the immune function decrease caused by cyclophosphamide and alleviate the intestinal damage caused by cyclophosphamide.Key words:Passion fruit peel polysaccharide;cyclophosphamide;immune regulation;intestinal barrier 为了保证生态系统可持续发展,保证国民健康,农业农村部 2019 年第 194 号文规定,自 2020 年1 月 1 日起,停止添加除中药类外其他促生产药物1。因此,绿色安全养殖是发展的重大趋势。研究发现,在饲料中添加植物提取物可调节牲畜的免疫系统,起到积极防御疾病的作用2。植物多糖能够增强机体免疫力,提高肠道屏障功能,对多种疾病有较好的防治效果,具有绿色环保的特点3-5。百香果皮占整个果实的 50%,含有丰富的多糖,且价格低廉6。已有研究表明,百香果皮多糖具有良好的抗氧化、抗炎等作用7。为了进一步阐明百香果皮多糖的免疫调节功效,本试验采用环磷酰胺制备雏鸡免疫抑制模型,通过在日粮中添加百香果皮多糖,研究百香果皮多糖对环磷酰胺免疫抑制的调节作用。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 药材与试剂百香果皮购于南宁市水果市场;黄芪多糖(含量60%)购于桂林华艺药业有限公司;硫酸购于广东光华科技股份有限公司;无水乙醇、苯酚、无水葡萄糖购于成都市科隆化学品有限公司;环磷酰胺购于碧云天生物技术公司;鸡新城疫活疫苗(La Sota株)购于杨凌绿方生物工程有限公司;HE 染液套装、阿利新蓝染液套装购于 Servicebio 生物科技有限公司;细胞因子试剂盒购于南京博研生物有限公司。1.1.2 试验动物1 日龄健康雏鸡,购于广西富凤农牧集团有限公司。1.2 试验方法1.2.1 百香果皮多糖的提取及多糖含量的测定百香果皮洗净后切成小块,置于 50 烘箱烘至恒重。按料液比值 120 加入去离子水,进行 95 水浴,加热 1 h 后过滤、旋转蒸发仪浓缩后用 80%乙醇醇沉后冷冻,苯酚硫酸法测定多糖含量。1.2.2 动物试验设计将体重相近的 1 日龄健康雏鸡适应性饲喂一周,7 日龄时随机分为 4 组:对照组、模型组、黄芪多糖组、百香果皮多糖组,每组 4 个重复,每个重复 10只。1000 mg/kg 多糖进行拌料饲喂,不同日龄健康雏鸡的试验设计及处理见表 1。表 1 试验设计及处理日龄处理1 日预饲一周7 日随机分组,开始饲喂相应的饲料14 日新城疫疫苗滴鼻点眼免疫28 日新城疫疫苗二次免疫29、31、33 日龄除对照组外,所有组每日胸肌注射 60 mg/kg 环磷酰胺35 日龄称重、采集样品(血清、免疫器官、空肠组织等)42 日龄采集血清,测定新城疫 HI 抗体水平2杨蒙蒙,等:百香果皮多糖对环磷酰胺诱导的雏鸡免疫抑制的调节作用1.2.3 试验指标测定1.2.3.1 免疫器官指数测定 各组雏鸡采血处死后,分别摘取胸腺、法氏囊、脾脏,轻轻吸干水分并称重。免疫器官指数按以下公式计算:免疫器官指数(mg/g)=免疫器官重量(mg)/活体重(g)1.2.3.2 新城疫抗体效价的测定 分别在 35、42 日龄,每组随机选取 6 只雏鸡,采集血液分离血清,HI 试验测定新城疫抗体效价8。1.2.3.3 IgM、IgG 含量测定 采集 35 日龄雏鸡血液于无菌离心管中,3000 rpm,4离心 20 min 后取上清,分装后-80保存。按 ELISA 试剂盒使用说明书测定各组样品中 IgM、IgG 含量。1.2.3.4 细胞因子含量测定 采集 35 日龄雏鸡血液于无菌离心管中,3000 rpm,4离心 20 min 后取上清,分装后-80保存。按 ELISA 试剂盒使用说明书测定 各 组 样 品 中TNF-、IFN-、IL-1、IL-10、IL-4、IL-6 含量。1.2.3.5 肠道指标测定 将分离的空肠组织用 10%中性福尔马林常温固定24 h,酒精脱水,石蜡包埋后置于石蜡切片机切成 34 m 的薄片。使用苏木精-伊红(H&E)、阿利新蓝(AB-PAS)对空肠切片染色,制成 H&E 切片、AB-PAS 切片。1.3 数据统计分析采用 IBM.SPSS 24 统计软件进行单因素方差分析。P0.05 表示差异显著,P0.01 表示差异极显著。2 结果2.1 百香果皮多糖含量测定在 490 nm 的波长下测定葡萄糖含量并绘制标准曲线(图 1),根据标准葡萄糖浓度对应的吸光值,得 到 回 归 方 程:y=3.12x+0.0249,R2=0.9981。通过方程计算可得,样品中百香果皮粗多糖含量为 52.31%。图 1 葡萄糖标准曲线2.2 百香果皮多糖对雏鸡免疫器官指数的影响如图 2 所示,与对照组相比,35 日龄模型组雏鸡的胸腺指数、法氏囊指数、脾脏指数均极显著缩小(P0.01),表明造模成功。与模型组相比,百香果皮多糖组各免疫指数增高,表明在日粮中添加百香果皮多糖可以改善环磷酰胺引起的免疫器官萎缩。注:与对照组比较:#P0.05,#P0.01,#P0.001;与模型组比较:P0.05,P0.01,P0.001(下同)图 2 百香果皮多糖对雏鸡免疫器官指数的影响2.3百香果皮多糖对雏鸡新城疫 HI 抗体效价的影响如图3 所示,在注射环磷酰胺后,相比于对照组,35 日龄和42 日龄模型组雏鸡的 HI 抗体效价均极显著降低(P0.01),黄芪多糖组和百香果皮多糖组 35、42日龄雏鸡的 HI 抗体均显著高于模型组(P0.05)。2.4 百香果皮多糖对雏鸡血清免疫球蛋白的影响如表 2 所示,与对照组相比,35 日龄模型组雏鸡 IgM 极显著下降(P0.01)、IgG 显著下降(P0.05)。黄芪多糖组与百香果皮多糖组雏鸡的 IgM、IgG 相比于模型组,IgM 极显著升高(P0.01)、IgG显著升高(P0.05)。3杨蒙蒙,等:百香果皮多糖对环磷酰胺诱导的雏鸡免疫抑制的调节作用图 3 百香果皮多糖对雏鸡新城疫 HI 抗体效价的影响2.5 百香果皮多糖对雏鸡细胞因子的影响如表 3 所示,相比于对照组,模型组雏鸡血清中 TNF-,INF-、IL-4、IL-1、IL-6 均极显著降低(P0.001)。相比于模型组,黄芪多糖组与百香果皮多糖组雏鸡血清中 IL-10 显著升高(P0.01),TNF-、INF-、IL-4 和 IL-10、IL-1、IL-6 均极显著升高(P0.001)。表 2 百香果皮多糖对雏鸡血清中免疫球蛋白的影响pg/mL项目对照组模型组黄芪多糖组百香果皮多糖IgM731.8523.23473.6023.36#664.3334.85 614.8920.10 IgG1928.4149.141351.3583.45#1772.12121.481788.1693.88表 3 百香果皮多糖对雏鸡细胞因子的影响pg/mL项目对照组模型组黄芪多糖组百香果皮多糖TNF-67.201.3337.602.27#64.392.38 54.692.56 IFN-61.774.3539.054.69#62.413.38 61.345.34 IL-1610.3618.23360.9314.53#498.6718.05 500.6317.58 IL-1056.091.4337.792.87#54.902.7050.132.57IL-4121.984.3581.044.69#110.123.38 111.915.34 IL-623.910.7015.840.31#24.191.19 19.501.04 2.6 百香果皮多糖对雏鸡肠道损伤的影响如图 4 所示,HE 染色结果表明,对照组空肠形态完整,肠绒毛长度较长纤细,隐窝较浅;模型组肠道结构受到损伤,肠道绒毛断裂萎缩,变粗。百香果皮多糖组相比于模型组,肠道结构较完整,绒毛较长,且隐窝较浅,有效缓解环磷酰胺造成的损伤。AB-PAS 染色结果表明,模型组空肠的杯状细胞显著少于对照组;相比于模型组,黄芪多糖组与百香果皮多糖组雏鸡空肠中的杯状细胞数量较多。A:空肠 HE 染色(比例尺=500 nm);B:空肠 AB-PAS 染色(比例尺=100 nm)图 4 百香果皮多糖对雏鸡肠道损伤的影响4杨蒙蒙,等:百香果皮多糖对环磷酰胺诱导的雏鸡免疫抑制的调节作用 如图 5 所示,相比于对照组,模型组雏鸡空肠单位面积内的隐窝数量极显著减少(P0.01)、隐窝深度极显著升高(P0.01)、绒隐比值极显著降低(P0.01)。相比于模型组,百香果皮多糖组雏鸡空肠单位面积内的隐窝数量显著增多(P0.05)、隐窝深度极显著下降(P0.01)、绒隐比值极显著升高(P0.05)。A:空肠单位面积内的隐窝数量;B:空肠隐窝深度;C:空肠绒毛与隐窝深度比值图 5 百香果皮多糖对雏鸡肠道绒毛和隐窝的影响3 讨论 环磷酰胺是一种抗癌药物,也是一种免疫抑制剂,可引起免疫功能丧失及肠道屏障损伤9。胸腺、脾脏、法氏囊等免疫器官指数常用来衡量禽类的免疫状况10。冯炎等11通过注射环磷酰胺可引起免疫器官的缩小,并且免疫抑制时间随着剂量增大而延长。有研究表明,雏鸡日粮中添加 900 mg/kg的 辐射黄芪多糖,能缓解环磷酰胺造成的免疫器官缩小,提高胸腺指数和脾脏指数12。Yao 等13在日粮中添加鸡血藤多糖,可提高免疫抑制鸡的体重和法氏囊与脾脏指数。本试验结果表明,环磷酰胺降低了免疫器官指数,而百香果皮多糖在一定程度上缓解了环磷酰胺造成的雏鸡免疫器官缩小,与上述研究结果一致。研究表明,百合多糖、麦冬多糖、大枣多糖均能提高鸡只新城疫抗体水平14。本试验结果显示,环磷酰胺可显著降低新城疫抗体水平,而百香果皮多糖可提高免疫抑制雏鸡体内的抗体水平,这与郭立伟等15报道相一致。体液免疫是机体抵抗疾病的重要途径之一,接种疫苗产生抗体水平的高低可直观地反映其免疫功能16。IgG 是由法氏囊、脾脏、淋巴结、骨髓中的浆细胞产生的,最易渗出血管参与免疫的分子17。IgM 是由次级淋巴器官中的浆细胞最早产生的,是B 细胞分化过程中的主要的表面标志物,在补体激活、病毒中和、调理吞噬及凝集作用中发挥重要作用18。蔡高峰等19研究发现,刺糖多糖可显著升高血清中新城疫 HI 抗体水平及 IgG 含量。研究表明,构树多糖20、牛大力多糖21等均能提高免疫抑制小鼠血清中 IgG、IgM 的水平。本研究中,百香果皮多糖能够显著缓解环磷酰胺造成的免疫低下。大量研究表明,多糖可刺激细胞因子的产生22。TNF-是巨噬细胞分泌的细胞因子,主要参与免疫调节,INF-参与细胞免疫。IL-10 与 IL-4参与单核细胞、T 淋巴细胞的增殖以及炎症反应;IL-10 可促进 B 细胞的增殖和产生抗体;IL-1 能促进胸腺细胞和 T 细胞的活化、增殖与分化;IL-6介导体液免疫23-26。Li 等27研究发现,白术多糖可显著维持胸腺正常细胞形态,缓解 GMC-SF、IL-1、IL-5、IL-6、TGF-水平下降,缓解环磷酰胺诱导的胸腺和淋巴细胞中 novel_mir2、CD25 和 CD28信号通路的相对 mRNA 表达降低。Niu 等28使用海棠花多糖提前 21 天干预小鼠后,再连续 4 天给予环磷酰胺,发现海棠多糖组的脾脏组织中 IL-2、IL-6、TNF-、IFN-的 mRNA 表达量显著升高。本研究结果与上述一致,百香果皮粗多糖可以改善环磷酰胺造成的细胞因子水平低下。5杨蒙蒙,等:百香果皮多糖对环磷酰胺诱导的雏鸡免疫抑制的调节作用 小肠的形态结构是评价小肠的功能的重要指标29。隐窝深度与肠上皮细胞的生成率成反比,绒毛高度/隐窝深度(V/C)下降表明肠道受损,营养吸收能力变差30。研究表明,多糖类物质能够通过调节肠道菌群、维持肠上皮细胞完整,提高肠道的免疫功能31。西洋参多糖可缓解 CTX 诱导的肠道损伤,增加肠道绒毛长度,杯状细胞数量29。构树叶粗多糖能维持环磷酰胺注射小鼠空肠组织完整,增加肠绒毛长度,缩小肠绒毛间隙20。本研究通过HE 和 AB-PAS 对空肠组织染色,结果表明,百香果皮粗多糖提前预处理雏鸡,可缓解环磷酰胺引起的肠道结构损伤,提高单位面积内隐窝数量、绒隐比值、降低隐窝深度,该结果与前人研究一致,表明百香果皮多糖可在一定程度上减轻环磷酰胺诱导的肠道损伤,保护肠道形态。4 结论 百香果皮多糖能够提高免疫抑制雏鸡的免疫器官指数、新城疫抗体水平、细胞因子、隐窝数量、绒隐比值、杯状细胞数量,缓解环磷酰胺诱导的免疫抑制和肠道屏障损伤。参考文献:1 骆中和.无抗时代行业趋势与发展思路J.湖南饲料,2021(01):3-4.2 郭世宁.中兽医药在减抗替抗上的几点思考J.畜牧产业,2020(05):62-64.3 Wang Z,Xie J,Yang Y,et al.Sulfated cyclocarya paliurus polysaccharides markedly attenuates inflammation and oxidative damage in lipopolysaccharide-treated macrophage cells and miceJ.Scientific Reports,2017,7:40402.4 王登辉,李欣怡,程国良,等.中药糖类上市药物研究进展J.化学试剂,2023:1-10.5 王军海,马呈瑞.禽用中药免疫增强剂的研究进展J.水禽世界,2016(01):42-45.6 汪美凤,李文娟,吴双双,等.百香果果皮生物活性成分提取与开发利用研究进展J.安徽农业科学,2022,50(19):16-19.7 韦晓芳.百香果皮多糖对脂多糖刺激的广西灵山麻鸡免疫、抗氧化功能及肠黏膜屏障的影响研究D.广西大学,2022.8 刘娜,朱琳,王玉建,等.泰山松花粉多糖对新城疫-禽流感二联灭活苗的免疫增强作用J.中国兽医学报,2018,38(11):2068-2072.9 张艳艳,孙丽丽,潘绵立,等.益神颗粒对环磷酰胺免疫抑制小鼠免疫功能及肠道菌群的影响J.中成药,2023,45(02):603-608.10 Liu J,Chen X,Yue C,et al.Effect of selenylation modification on immune-enhancing activity of Atractylodes macrocephala polysaccharide J.International Journal Biological Macromolecules,2015,72:1435-1440.11 冯焱,赵恒寿,刘佳斌,等.环磷酰胺对肉仔鸡免疫机能的影响J.饲料博览(技术版),2007(10):31-34.12 Li 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