超声造影对兔糖尿病肾病模型早期微循环血流灌注变化的实验研究.pdf

医学影像学杂志2024年第34 卷第2 期 J Med Imaging Vol.34 No.2 2024超声造影对兔糖尿病肾病模型早期微循环血流灌注变化的实验研究孙孝杰1，王军21.太原钢铁（集团）有限公司总医院健康体检中心 山西 太原 030008；2.山西省太原市中心医院超声医学科 山西 太原 030009【摘 要】目的探讨分析兔糖尿病肾病模型早期微循环血流灌注变化。方法研究对象为 80 只健康雄性新西兰兔，随机分为对照组（健康兔）和糖尿病肾病组。经耳缘静脉快速注射 2.5四氧嘧啶溶液（100 mg/kg）建立糖尿病兔模型，同时对照组兔子注射同剂量生理盐水。建模成功 1 周、2 周、4 周、6 周、8 周、10 周、12 周后随机处死一只兔，取双肾作病理标本。两组兔分别在造模结束后 3 天、1 周、2 周、4 周、6 周、8 周、10 周、12 周均经耳缘静脉团注造影剂，后迅速注射生理盐水 1.5 ml 冲洗管道，进行实时超声造影，造影结束后，处死兔行 Masson 染色，观察病理改变。利用时间-强度定量分析软件分析两组兔不同阶段肾皮质的血流灌注变化。结果时间强度曲线参数：建模 1 周、2 周后峰值强度呈上升趋势，曲线下面积（AUC）增大、达峰时间（TTP）减少，曲线增强上升斜率（AS）增大，建模 4 周、6 周后，峰值强度、AUC 均较对照组升高，TTP、AS 均与对照组类似，建模 8 周、10 周、12 周，TTP 增多，AS 减缓，峰值强度减半时间增长、峰值强度下降。病理结果显示 1 周、2 周肾小球增大，系膜基质、基底膜无异常；4 周、6 周系膜细胞上升；8 周、10 周、12 周肾小球系膜细胞增多、基底膜厚度增加，大部分毛细血管管腔闭塞，部分肾小球硬化。结论超声造影作为一项简单方便的检查技术，可对早期兔糖尿病肾病早期微循环血流灌注变化展开定量分析，能够有效反映肾脏病理改变，为糖尿病肾病早期治疗提供依据。【关键词】超声检查；糖尿病肾病；兔；微循环；血流灌注中图分类号：R587.1；R445.1 文献标识码：A 文章编号：1006-9011（2024）02-0112-04Experimental study of contrast-enhanced ultrasound to evaluate the changes of microcirculation blood perfusion in early stage of rabbit diabetic nephropathy modelSUN Xiaojie1，WANG Jun21.Department of Taiyuan Iron and Steel（Group）Co，LTD.General Hospital health examination center，Taiyuan 030009，China2.Department of Ultrasound Medicine，Taiyuan Central Hospital，Taiyuan 030009，China【Abstract】ObjectiveTo analyze the changes of microcirculation blood perfusion in the early stage of rabbit diabetic nephropathy model.Methods80 healthy male New Zealand rabbits were randomly divided into healthy group and diabetic nephropathy group.The diabetic rabbit model was established by rapid injection of 2.5%alloxouracil solution（100 mg/kg）through the auricular vein，while the healthy rabbits were injected with the same dose of normal saline.After 1，2，4，6，8，10 and 12 weeks of successful modeling，one rabbit was randomly killed and both kidneys were taken as pathological specimens.At 3 days，1 week，2 weeks，4 weeks，6 weeks，8 weeks，10 weeks and 12 weeks after the end of modeling，rabbits in both groups were injected with contrast agent through the ear margin vein mass，and then 1.5 ml of normal saline was quickly injected into the irrigation pipeline to perform real-time CEUS.After the end of imaging，rabbits were killed and Masson staining was performed to observe the pathological changes.The changes of blood perfusion in renal cortex of two groups were analyzed by time-intensity quantitative analysis software.Results Time-intensity curve parameters：After 1 and 2 weeks of modeling，the peak intensity showed an upward trend，the area under the curve（AUC）increased，the peak time to reach the peak（TTP）decreased，and the curve enhancement slope（AS）increased.After 4 and 6 weeks of modeling，the peak intensity and AUC were both higher than that of the control group，and TTP and AS were similar to the control group.After 8，10 and 12 weeks of modeling，TTP increased.AS slowed down，the peak intensity halved，and the peak intensity decreased.Pathological results showed，at 1 week，2 weeks，glomerular enlargement，mesangial matrix，basement membrane had no abnormality；at 4 weeks，6 weeks，mesangial cells increased；at 8 weeks，10 weeks，12 weeks，mesangial cells increased，basement membrane thickness increased，most of the capillary lumen blocked，part of the glomerular sclerosis.Conclusion As a simple and convenient examination technique，contrast-enhanced ultrasound can quantitatively analyze the changes of microcirculation blood perfusion in the early stage of rab基金项目：山西省卫生健康委科研课题计划项目（编号：2021034）作者简介：孙孝杰（1983-），男，医学硕士，副主任医师，主要从事超声诊断与介入治疗工作实验研究112医学影像学杂志2024年第34 卷第2 期 J Med Imaging Vol.34 No.2 2024bit diabetic nephropathy，which can effectively reflect the pathological changes of kidney and provide evidence for the early treatment of diabetic nephropathy.【Key words】Ultrasound；Diabetic nephropathy；Rabbit；Microcirculation；Blood perfusion糖尿病肾病引发的终末期肾功能衰竭是糖尿病患者死亡的主要原因之一1-3。糖尿病肾病发病具有隐匿性，早期肾功能损伤可逆转4。一旦进入大量蛋白尿期后，病情会迅速进展为终末期肾病，导致患者需要肾移植或透析治疗维持生命，故糖尿病肾病的早期诊断具有重要意义。目前病理活检仍为糖尿病肾病诊断的金标准，但因其属于侵入性操作，存在样本误差，可重复性差，并不能作为早期诊断和疗效随访的有效评估工具。糖尿病肾病的进展与血流灌注密切相关，因此精准的评估其血流灌注特点对诊断肾脏疾病而言十分关键5。超声造影（CEUS）作为无创检查技术，能够较好的检测肾脏微血管灌注状态。本研究旨在探究兔糖尿病肾脏模型的早期肾微循环灌注特点，以期为早期糖尿病肾病诊疗工作提供参考依据。1资料与方法1.1实验动物选取纯种健康新西兰雄性大白兔80只，由山西医科大学提供，体质量 2.02.5 kg，平均体质量（2.76 1.33）kg，60周龄。随机分为对照组（健康兔20只）和糖尿病肾病组（60只）。1.2模型建立使用生理盐水、四氧嘧啶-水合物配置成2.5溶液，以 1ml/kg比例肌肉注射 5戊巴比妥钠对实验兔麻醉，经耳缘静脉快速注射2.5四氧嘧啶溶液（100 mg/kg）建立糖尿病兔模型，48h后兔可自由摄取 10葡萄糖溶液，72h 后监测血糖值超过16.0mmol/L，尿出现微量白蛋白，提示模型建立成功。同时对照组兔注射同剂量生理盐水，建模成功后所有兔均自由摄食、饮水。1.3超声造影采用百胜MyLab TM9型超声仪，在造模成功后3天、1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周对糖尿病肾病组和对照组进行超声造影检查。启用低机械指数（mechanical index，MI）造影技术，Small Parts 造影模式。常规扫查选定兔肾长轴最大切面行超声造影检查，探头目标置于屏幕中央，放大图像。经耳缘静脉团注造影剂，后迅速注射生理盐水1.5 ml冲洗管道，行实时超声造影检查。设置MI0.1，启动系统内存储计时器，实时动态观察肾脏灌注情况，间隔时间应超过15 min。1.4病理观察建模成功1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周后随机处死一只兔，取双肾作病理标本。超声造影结束后处死所有实验兔，观察病理改变情况。于肾门水平横切肾组织，用10甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，并采用Masson染色，光学显微镜（Olympus公司）下观察病理改变情况。1.5定量分析选取肾脏感兴趣区域（ROI）展开量化分析，选取肾皮质中部外侧皮质区域，避开动脉区域。仪器自动拟合出时间-强度曲线，软件自动计算并显示病灶区域与正常区域的峰值强度、曲线下面积（AUC）、达峰时间（TTP）减少，曲线增强上升斜率（AS）等参数。2结果2.1两组不同时间肾脏组织CEUS参数比较60只实验兔均成功制备成糖尿病肾病模型，均成活。时间-强度曲线参数：建模1周、2周后峰值强度呈上升趋势，曲线下面积（AUC）增大、达峰时间（TTP）减少，曲线增强上升斜率（AS）增大，建模 4周、6周后，峰值强度、AUC均较对照组升高，TTP、AS均与对照组类似，建模8周、10周、12周，TTP增多，AS 减缓，峰值强度减半时间增长、峰值强度下降（图1，2）。2.2病理改变情况肾病组病理结果显示：1周、2周肾小球增大，系膜基质、基底膜无异常；4周、6周系膜细胞上升；8周、10周、12周肾小球系膜细胞增多、基底膜厚度增加，大部分毛细血管管腔闭塞，部分肾小球硬化。肾脏病理；造模成功后1周，肾小球肥大；造模成功后4周，肾小球系膜基质略微增生，基底膜未见增厚；造模成功后8周，肾小球中度系膜增生；造模成功后12周，肾小球中重度系膜增生，肾小球系膜区节段性硬化，肾小管上皮细胞颗粒样变性、空泡变性；对照组各时间点肾脏病理观察肾小球大小、形态等均无异常（图3）。3讨论糖尿病肾病是糖尿病严重的微血管并发症，肾功能受损最初无明显临床症状，病情持续加深会引发慢性肾功能不全，糖尿病肾病早期无明显临床表现，肾功能早期评估存在难度6-7。早期应用合理的113医学影像学杂志2024年第34 卷第2 期 J Med Imaging Vol.34 No.2 2024药物治疗能够逆转糖尿病肾损伤、改善高血流灌注状态，挽救患者生命。然而目前缺少对肾功能评估的无创检测手段。医学影像学作为一种无创影像学评估工具，可用于评估肾脏的血流灌注状态、功能，甚至间质改变等。因其具有操作便捷、经济适用性高、易获得的特点，成为肾脏辅助检查的重要手段8。CEUS 能够较好的显示血管血流状态，通过时间-强度定量分析感兴趣区的造影剂回声信号，能够对肾皮质微循环状态进行客观准确的评估。比较常规二维超声检查，CEUS作为功能性成像评估工具，在评估肾功能变化方面更具优势9。相关研究10显示肾皮质微循环血流灌注降低会导致肾功能降低，糖尿病肾脏早期血流动力学表现为肾皮质微循环高灌注。随着糖尿病肾病病情加深，造影剂进入肾微小血管剂量减少，循环速率减弱11。本研究通过仪器内置软件获得出时间-强度曲线反映血液中造影剂浓度强弱，用于评估肾脏是否出现高血流灌注状态。本研究时间强度曲线参数显示：建模1周、2周后峰值强度呈上升趋势，曲线下面积（AUC）增大、3A3B3C3D3E图3对照组和糖尿病组各时间点肾脏病理观察（Masson200）。图3A 对照组显示，正常肾脏组织结构；图3B 肾病组造模成功后1周，肾小球肥大；图3C 造模成功后4周，肾小球系膜基质略微增生，基底膜未见增厚；图3D 造模成功后8周，肾小球中度系膜增生；图3E 造模成功后12周，肾小球中重度系膜增生，肾小球系膜区节段性硬化，肾小管上皮细胞颗粒样变性、空泡变性。1A1B2A2B2C2D2E2F2G图1不同时间肾脏组织CEUS参数变化。图1A 正常对照组；图1B 造模成功后3天，各参数无明显变化。图2肾病组不同时间肾脏组织CEUS参数变化。图2A，2B 造模成功后1周、2周，皮质峰值强度、曲线下面积、曲线上升斜率均明显大于对照组，达峰时间明显小于对照组；图2C，1D 造模成功后4周、6周，皮质峰值强度、曲线下面积高于对照组，与1周、2周比较有降低趋势；图2E2G 造模成功后8周、10周、12周，达峰时间延长、曲线上升斜率减慢、峰值强度减半时间延长、曲线下面积增大。114医学影像学杂志2024年第34 卷第2 期 J Med Imaging Vol.34 No.2 2024达峰时间（TTP）减少，曲线增强上升斜率（AS）增大，建模4周、6周后，峰值强度、AUC均较对照组升高，TTP、AS 均与对照组类似，建模 8 周、10 周、12 周，TTP增多，AS减缓，峰值强度减半时间增长、峰值强度下降。说明糖尿病肾病发病初期（1周、2周）肾脏血流灌注速率及流量明显增加，推测其与高血糖状态改变血流动力学有关。糖尿病肾病发病中期（4周、6周）肾脏血流灌注速率明显降低，与正常值贴近，究其原因可能与糖尿病发病初期肾脏一直处于高血流灌注状态，生成大量系膜细胞，系膜细胞对血管收缩因子的敏感性上升，收缩力增强，导致肾小球毛细血管出现一定程度的收缩，削弱血流灌注速度有关12。糖尿病肾病发病后期（8周、10周、12周），肾小球系膜基质增生，毛细血管基底膜增厚，系膜区持续扩张，导致大部分毛细血管管腔狭窄或闭塞，血液循环受阻，血流灌注速度持续减弱13。本研究病理结果显示：1周、2周肾小球增大，系膜基质、基底膜无异常；4周、6周系膜细胞上升；8周、10周、12周肾小球系膜细胞增多、基底膜厚度增加，大部分毛细血管管腔闭塞，部分肾小球硬化。持续的高血糖会改变血流动力学状态，肾小球呈现高灌注、高滤过、高压力的临床特征，导致肾小球滤过率升高。随着病情发展，肾小球毛细血管壁受损，导致系膜基质、毛细血管壁损伤，合成大量的细胞基质14，持续的血流高灌注导致血浆中大分子无法通过血管壁，进一步促进细胞基质合成，形成恶性循环。同时毛细血管管腔增厚，血流灌注减少，从而导致部分肾小球硬化。CEUS能够反映糖尿病肾病兔微循环血流灌注情况，能够预测早期肾功能改变，具有良好的临床应用前景。但其评估参数并没有形成一个固定的标准，这与机器厂家、造影剂剂量、存储图像时间等有关，其固定的诊断标准仍需未来展开大样本、统一设定研究条件去实现。同时本研究考虑兔死亡风险，并没有将病理活检作为判断造模成功的标准，未来需进一步验证本研究结论的准确性。综上所述，CEUS 作为一项简单方便的检查技术，可对兔糖尿病肾病早期微循环血流灌注变化展开定量分析，能够有效反映肾脏病理改变，为糖尿病肾病早期治疗提供依据。参考文献：1CHO N H，SHAW J E，KARURANGA S，et al.IDF Diabetes Atlas：Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045J.Diabetes Res Clin 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